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鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5的原核表达及特性分析

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浙江农业学报 2015年第10期27卷 1704-1709页

作者：韩凯凯李银黄欣梅赵冬敏刘宇卓刘青涛谢星星安凤娇江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表... 详细信息

通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。

关键词：鹅坦布苏病毒 NS5蛋白原核表达

樱桃谷鸭OASL基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

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江苏农业学报 2017年第2期33卷 -页

作者：毕可然韩凯凯李银刘青涛赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为了获得樱桃谷鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白质基因(OASL)全长cDNA,并且初步了解其生物学特性,采用RT-PCR和RACE方法从鸭脾脏组织总RNA中扩增OASL基因cDNA片段,应用生物信息学方法,系统分析鸭OASL的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级结构... 详细信息

为了获得樱桃谷鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白质基因(OASL)全长cDNA,并且初步了解其生物学特性,采用RT-PCR和RACE方法从鸭脾脏组织总RNA中扩增OASL基因cDNA片段,应用生物信息学方法,系统分析鸭OASL的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级结构和亚细胞定位。结果表明,樱桃谷鸭OASL基因(Gen Bank登录号:KX255654)全长1 630 bp,其中包含19 bp的5'UTR(Untranslated region,UTR)、99 bp的3'UTR(Untranslated region,UTR)和PolyA尾巴、1 512 bp的编码区(Coding region,CDS),翻译编码504个氨基酸多肽。鸭OASL蛋白具有寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白家族的典型特征,即N端为寡腺苷酸合成酶样结构域(OAS-like domain,OLD),C端为2个串联的泛素化样结构域(Ubiquitin-like domains,Ub LDs),不具有信号肽和跨膜区。序列比对和系统进化分析结果表明,OASL氨基酸序列在同种之间比较保守,与已报道的鸭OASL的同源性高达100%,与鹅同源性为78%,与人、鼠和猪等哺乳动物的同源性仅为43%~45%。

关键词：樱桃谷鸭 OASL基因 RACE 生物信息学分析

小鼠转录因子STAT1真核表达质粒的构建及生物学功能分析

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江苏农业学报 2019年第1期35卷 136-141页

作者：韩凯凯赵冬敏毕可然章丽娇刘青涛刘宇卓黄欣梅杨婧李银江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

本研究以小鼠组织的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到小鼠信号转导子和转录激活子1(STAT1)基因完整开放阅读框的碱基序列,然后将其克隆到真核表达载体p DsRed-N1中,构建p DsRed-N1-STAT1重组质粒。测序成功的真核质粒转染至BHK-21细胞,... 详细信息

本研究以小鼠组织的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到小鼠信号转导子和转录激活子1(STAT1)基因完整开放阅读框的碱基序列,然后将其克隆到真核表达载体p DsRed-N1中,构建p DsRed-N1-STAT1重组质粒。测序成功的真核质粒转染至BHK-21细胞,通过α干扰素(IFN-α)分子刺激,检测细胞中STAT1分子的活化状态与定位,最终通过坦布苏病毒刺激,荧光显微镜检测STAT1分子的细胞内定位。结果表明,小鼠的STAT1基因开放阅读框为2 250 bp,编码749个氨基酸。同源性比对结果表明,小鼠STAT1与人、大鼠、猪、马等哺乳动物STAT1氨基酸序列的一致性分别为92%、97%、91%、91%。转染结果表明,构建的p DsRed-N1-STAT1真核表达质粒在BHK-21细胞中成功表达,无IFN-α刺激时,红色荧光只在BHK-21细胞的细胞质中出现,而加入IFN-α后,红色荧光则大多分布于细胞核内。用坦布苏病毒感染细胞后,红色荧光多分布于细胞质中。说明,构建的真核质粒p DsRed-N1-STAT1在哺乳动物细胞中能够正确表达融合蛋白质Red-STAT1,而且在IFN-α刺激下,Red-STAT1可由细胞质向细胞核转运,同时发现,坦布苏病毒感染能够有效抑制STAT1分子的核转运。

关键词：小鼠信号转导子和转录激活子1 α干扰素

H7-HCP-Tir-Intimin高效降低小鼠粪便中大肠杆菌O157:H7排菌

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中国兽医学报 2014年第3期34卷 465-470页

作者：张雪寒何孔旺叶青俞正玉倪艳秀温立斌王小敏李彬周俊明汪伟江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低*** O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间... 详细信息

构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低*** O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间隔序列,构建重组菌BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae)。进口白油和ISA50V作为佐剂与重组蛋白乳化,制备2种油乳剂疫苗,分别接种4周龄BALB/c雄鼠,二免21d,口服攻击*** O157:H7109 CFU/只,每天采集粪便,检测排菌。结果显示,2种重组疫苗均能够诱导高滴度血清IgG。ISA50V佐剂组抗体产生早于进口白油佐剂组,但进口白油佐剂组抗体滴度一致性更好。所有免疫组小鼠排菌极度降低,第1天排菌低于104 CFU/g,第5天检测不到排菌,整个检测期无反弹,而对照组在整个检测期排菌持续很高(>104 CFU/g)。结果表明,四价重组蛋白H7-HCP-Tir-Intimin能够高效降低口服大肠杆菌O157:H7后的排菌,极显著降低细菌的定植,很大程度减少病原传播,对环境和人类的威胁。

关键词： E coli 0157 H7 鞭毛 Ⅳ菌毛紧密素转位受体蛋白紧密素疫苗排菌小鼠

A型禽流感病毒M2e重组T7噬菌体疫苗构建及免疫原性研究

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病毒学报 2013年第4期29卷 376-381页

作者：徐海王义伟唐应华郑其升侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果。比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e。经PCR鉴... 详细信息

构建展示A型禽流感病毒M2e多肽的重组T7噬菌体,检测其对SPF鸡的免疫保护效果。比对GenBank近期发表的A型禽流感病毒M2e基因序列进行人工合成并重复至两拷贝,将其克隆到T7Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-M2e。经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernblot检测重组噬菌体表面M2e多肽。重组噬菌体以1×1010pfu/只剂量免疫SPF鸡,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗M2e抗体,免疫荧光检测血清抗体与H9亚型禽流感病毒的结合能力,并以200个EID50/只剂量进行攻毒保护效率检测。成功构建重组噬菌体T7-M2e,插入两拷贝M2e基因获得表面展示,并与M2e抗体有免疫反应活性。噬菌体疫苗免疫后均产生抗M2e抗体,其抗血清能跟病毒粒子特异性结合,攻毒保护率达4/5(80%)。获得了展示禽流感病毒M2e多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫鸡产生较高血清抗体并提供攻毒保护,为新型通用禽流感疫苗研制提供新思路。

关键词：禽流感病毒 M2e T7噬菌体噬菌体疫苗

禽流感病毒M2e、NP多表位嵌合肽抗原的构建及免疫原性

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微生物学报 2009年第6期49卷 807-812页

作者：徐海侯红岩邓碧华郑其升侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

【目的】为了克服传统禽流感疫苗各亚型之间无交叉保护的缺陷,研制抗禽流感通用型疫苗。【方法】以禽流感病毒M2e、NP表位为基础串联T细胞表位构建4个原核表达载体:pET-3M2e、pET-3M2e-NP1,2-Fc、pET-3M2e-NP1,2、pET-TCE-3M2e-NP1,2。... 详细信息

【目的】为了克服传统禽流感疫苗各亚型之间无交叉保护的缺陷,研制抗禽流感通用型疫苗。【方法】以禽流感病毒M2e、NP表位为基础串联T细胞表位构建4个原核表达载体:pET-3M2e、pET-3M2e-NP1,2-Fc、pET-3M2e-NP1,2、pET-TCE-3M2e-NP1,2。纯化重组蛋白并与弗氏佐剂混合制成疫苗,胸部肌肉注射免疫20日龄非免鸡(150μg/只),4个融合蛋白分为四组,每组十只。ELISA方法检测血清中M2e抗体水平;在MDCK细胞上检测血清与H9N2亚型禽流感病毒的结合能力,在鸡胚上检测其中和能力;以流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞的变化。【结果】研究发现,各免疫组均能检测到高水平的ELISA抗体,免疫荧光显示抗血清均能跟病毒特异性结合,中和试验表明抗血清不能中和病毒但能抑制病毒的复制。流式细胞仪检测显示外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例在免疫后均有明显升高(P所占比例分别达到47.23%和36.77%,具有细胞免疫的特征。【结论】构建的嵌合肽抗原具有较好的免疫原性,能刺激机体产生体液和细胞免疫,为进一步研制抗禽流感通用型疫苗做出有益的探索。

关键词：禽流感病毒原核表达抗原表位保守序列

利用噬菌体随机肽库筛选可结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽序列

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微生物学报 2011年第1期51卷 127-133页

作者：徐海王继春于辙吕芳侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

【目的】采用完整的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)颗粒筛选噬菌体肽库,以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽。【方法】用纯化的病毒粒子包被ELISA板,再用M13噬... 详细信息

【目的】采用完整的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)颗粒筛选噬菌体肽库,以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽。【方法】用纯化的病毒粒子包被ELISA板,再用M13噬菌体随机12肽库进行筛选。经过3轮淘筛,ELISA鉴定噬菌体单克隆与PRRSV的亲和力,选取与PRRSV具有高亲和力的噬菌体单克隆进行DNA测序,据此推导多肽的氨基酸序列。通过TCID50检测其抗病毒复制能力,同时人工合成FITC标记的展示肽用于PRRSV的检测。【结果】经筛选和鉴定得到17个阳性噬菌体克隆能与PRRSV呈高亲和力结合,DNA测序发现各克隆之间有部分共有基序,其中2个克隆体外能明显抑制PRRSV的复制,使TCID50由10-7.3/0.1mL分别降至10-3.2、10-3.6/0.1mL,而FITC标记该展示肽能够在5mg/L工作浓度检测PRRSV。【结论】通过噬菌体肽库能够筛选到具有抗病毒作用的阳性噬菌体克隆,为进一步开发高效PRRSV的诊断和治疗试剂奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒噬菌体展示肽库序列免疫荧光

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猪鼻支原体与猪地方性肺炎

中国人兽共患病学报 2012年第10期28卷 1036-1039页

作者：王占伟熊琪琰邵国青江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状。Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发... 详细信息

猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状。Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发因素。Mhr引起猪肺炎的机理除了在病理变化方面有介绍外,其深层次的机制还未见报道,其在呼吸道移行及诱导全身性疾病的机制也不清楚。本文将从猪地方性肺炎(SEP)及主要致病原、可能的致病机理和研究方法方面进行阐述Mhr肺炎,为该病的研究和防治提供新思路与新手段,同时也为Mhr和其它病原共感染的研究提供借鉴。

关键词：猪鼻支原体猪地方性肺炎猪肺泡巨噬细胞体外感染致病机理

含禽流感病毒M2e氨基端抗原表位的重组传染性法氏囊病毒VP2蛋白的免疫原性鉴定

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微生物学报 2012年第6期52卷 753-759页

作者：唐应华宫玉珍王永伟陆吉虎吴培培高峰陈滔何家惠侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流... 详细信息

【目的】构建传染性法氏囊病毒VP2蛋白展示禽流感M2e抗原表位的重组蛋白,研发预防H5或H9亚型禽流感和传染性法氏囊的基因工程疫苗。【方法】根据现有禽流感疫苗株M2e的氨基端12个氨基酸多肽序列(nM2e)序列,结合GenBank中H5和H9亚型禽流感病毒nM2e的比对结果,确定nM2e序列。用融合PCR分别将1拷贝H5或H9的nM2e序列插入IBD B87株VP2基因的PBC区,获得VP2BCnM2e重组基因。将重组基因克隆至杆状病毒表达系统,转染Sf9细胞进行表达。经间接免疫荧光和Western blotting检测Sf9细胞表达重组基因后,扩繁重组病毒,制备疫苗,间隔4周对非免鸡作2次重复免疫,用间接ELISA和鸡胚成纤维细胞中的病毒血清中和试验检测血清中VP2和nM2e的抗体效价。【结果】成功构建含H5或H9 nM2e的VP2BCnM2e重组基因,该重组基因在Sf9细胞中得到表达。经免疫鸡,两重组蛋白均能激发针对VP2和nM2e的抗体,VP2BCnM2eH5组抗体效价高于VP2BCnM2eH9组。【结论】两重组蛋白均具有免疫原性,VP2BCnM2eH5免疫原性更佳。

关键词：禽流感病毒传染性法氏囊病毒 M2e VP2