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一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性与全基因组分析

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山东农业科学 2024年

作者：张雪丽于浩淼闫振贵杨少华张亮杨宏军山东省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽生物组学重点实验室山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室山东农业大学动物科技学院

本研究旨在分离具有高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体，为研制噬菌体生物制品提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌，用双层平板法分离噬菌体，通过透射电子显微镜观察噬菌体形态，并对其进行生物学特性分析及全基因组... 详细信息

本研究旨在分离具有高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体，为研制噬菌体生物制品提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌，用双层平板法分离噬菌体，通过透射电子显微镜观察噬菌体形态，并对其进行生物学特性分析及全基因组测序分析。结果分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体，效价达2.75×1010PFU/mL，命名为SP688；该噬菌体具有长的不收缩尾巴，属长尾噬菌体科；对7株耐氨苄西林金葡菌均有裂解效果；最佳感染复数为1，可在10 h内抑制细菌生长；在温度-20～54 ℃范围和pH值3～11之间活性稳定，对紫外线敏感。全基因组分析显示，SP688基因组为环状DNA，全长45 499 kb，GC含量为34.44%；预测到64个开放阅读框(ORFs)，其中19个基因(29.69%)被预测其功能。该噬菌体是一株新型裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的广谱噬菌体，可为噬菌体治疗提供材料。

关键词：金黄色葡萄球菌噬菌体形态生物学特性分析全基因组分析

超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中氨苄西林及其代谢物残留

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中国兽药杂志 2024年第5期58卷 34-44页

作者：黎乃添雍燕叶渭源黎健业吴玉枝方炳虎广东温氏大华农生物科技有限公司广东云浮527400 华南农业大学兽医学院广州510642 广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室广东肇庆526268

建立一种同时测定鸡蛋中氨苄西林及其主要代谢物氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的超高效液相色谱串联质谱方法。样品经乙腈水溶液(70∶30,V/V)提取、浓缩、SAX固相萃取小柱净化后,采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测。结果显示,氨苄... 详细信息

建立一种同时测定鸡蛋中氨苄西林及其主要代谢物氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的超高效液相色谱串联质谱方法。样品经乙腈水溶液(70∶30,V/V)提取、浓缩、SAX固相萃取小柱净化后,采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测。结果显示,氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪在1~200 ng/g的浓度范围内呈良好的线性关系。在鸡蛋中氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的检测限均为0.5 ng/g,定量限为1 ng/g。在1~100 ng/g添加浓度范围内,氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪在鸡蛋中的平均回收率分别为84.0%~96.2%、85.6%~96.4%和89.2%~95.8%,批内、批间RSD均小于10%。添加不同浓度药物的鸡蛋样品具有良好的长期冷冻放置稳定性和反复冻融稳定性。蛋鸡在服用氨苄西林后,所产鸡蛋均能检出氨苄西林、氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪,且氨苄西林酸和氨苄西林二酮哌嗪的残留量和残留时间高于氨苄西林原型。上述内容表明,该方法各项技术指标均能满足残留检测要求,可用于定量测定鸡蛋中氨苄西林及其主要代谢物的残留量。

关键词：鸡蛋氨苄西林超高效液相色谱串联质谱法药物残留

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单链抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2024年

作者：杜晨暄邹亚文张颜王智勇李丹彤喻蓓蕾蒋一凡王瑀琦何庆杨毅王乃东湖南农业大学动物医学院兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室兽用疫苗逆向创制湖南省工程研究中心湖南派智生物科技有限公司

为了获得特异性针对非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）CD2v蛋白单链抗体（scFv），本研究以CD2v阳性单克隆抗体杂交瘤细胞为模板，通过PCR扩增得到抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，利用Overlap-PCR在VH和V... 详细信息

为了获得特异性针对非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）CD2v蛋白单链抗体（scFv），本研究以CD2v阳性单克隆抗体杂交瘤细胞为模板，通过PCR扩增得到抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，利用Overlap-PCR在VH和VL基因间引入短肽（Gly4Ser）2连接形成scFv。将其插入原核表达载体pET28a（+）中，并转化至大肠杆菌BL21（DE3），经1 mmol/L IPTG于25 ℃条件下诱导表达，通过ELISA对复性scFv蛋白进行反应活性评价。结果显示，通过CD2v蛋白的阻断ELISA筛选出分泌阻断效果良好的单抗杂交瘤细胞株4B8，并成功扩增获得单克隆抗体4B8的重链可变区（VH，399 bp）、轻链可变区（VL，369 bp）及由GS Linker连接而成的4B8-scFv基因（744 bp）；SDS-PAGE结果显示，4B8-scFv在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式表达，通过尿素变性及透析复性，得到纯度较高的4B8-scFv（相对分子质量约为34 ku）；间接ELISA结果表明，4B8-scFv与CD2v蛋白具有良好的反应活性。

关键词：非洲猪瘟病毒单克隆抗体单链抗体 CD2v蛋白

非洲猪瘟病毒D1133L蛋白增加宿主波形蛋白磷酸化而促进病毒在猪巨噬细胞中的复制

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微生物学报 2024年第3期64卷 720-732页

作者：陈玲玲张婷郝雨杨金柯史喜绢张大俊杨行赵登率闫文倩别鑫恬陈国辉郑海学乐涛张克山重庆师范大学生命科学学院重庆401331 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133L蛋白波形蛋白蛋白互作磷酸化

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FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用

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山东农业科学 2024年第2期56卷 144-150页

作者：苗勤吴香菊齐静丛晓燕李均同王林杜以军山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室山东济南250100 农业农村部畜禽生物组学重点实验室山东济南250100

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR... 详细信息

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 3D蛋白真核表达 Ⅰ型IFN信号通路

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一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析

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山东农业科学 2024年第3期56卷 132-138页

作者：张雪丽于浩淼闫振贵杨少华张亮杨宏军山东省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽生物组学重点实验室山东济南250100 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室山东济南250100

本研究旨在分离能够高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体,为噬菌体生物制品的研制提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌,用双层平板法分离噬菌体,通过透射电子显微镜观察噬菌体形态,并对其进行生物学特性分析及全基因组测... 详细信息

本研究旨在分离能够高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体,为噬菌体生物制品的研制提供候选材料。以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌,用双层平板法分离噬菌体,通过透射电子显微镜观察噬菌体形态,并对其进行生物学特性分析及全基因组测序分析。结果分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体,效价达2.75×10^(10)PFU/mL,命名为SP688。该噬菌体具有长的不收缩尾巴,属长尾噬菌体科,对7株耐氨苄西林金葡菌均有裂解效果,最佳感染复数为1,可在10 h内抑制细菌生长,在温度-20~54℃范围和pH值3~11之间活性稳定,对紫外线敏感。全基因组分析显示,SP688基因组为环状DNA,全长45499 kb,GC含量为34.1%;预测到64个开放阅读框(ORFs),其中19个(29.69%)被预测功能。该噬菌体是一株新型裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的广谱噬菌体,可为噬菌体治疗提供材料。

关键词：金黄色葡萄球菌噬菌体形态生物学特性分析全基因组分析

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正交设计优化蟾酥注射液的提取工艺

现代畜牧兽医 2024年第2期 23-27页

作者：刘城志吴莉芩彭健波程楸琪吴春璇卢嘉烨梁正敏何家康广西大学动物科学技术学院广西南宁530003 广西农业职业技术大学广西南宁530009 广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530003

试验旨在优化蟾酥注射液的提取工艺,试验以吲哚类总生物碱(以5-羟色胺盐酸盐计)的含量为考察指标,以加水倍数(A)、加热温度(B)和提取时间(C)为考察因素,通过L_(9)(3^(4))正交试验优化蟾酥注射液的提取工艺,确定提取工艺参数,并采用最大... 详细信息

试验旨在优化蟾酥注射液的提取工艺,试验以吲哚类总生物碱(以5-羟色胺盐酸盐计)的含量为考察指标,以加水倍数(A)、加热温度(B)和提取时间(C)为考察因素,通过L_(9)(3^(4))正交试验优化蟾酥注射液的提取工艺,确定提取工艺参数,并采用最大极差法对正交试验数据分析处理。结果显示,加水倍数是影响蟾酥注射液主要成分含量的主要因素,蟾酥注射液的最佳提取工艺为10倍加水量浸泡,加热煮沸(100℃),提取时间4 h。验证性试验按最优工艺制备3批样品,采用紫外可见分光光度(UV)法测定蟾酥注射液中吲哚类总生物碱的含量为9.92 mg/L。研究表明,该提取工艺稳定可靠,可用于中试生产。

关键词：蟾酥注射液提取工艺正交试验 UV法 5-羟色胺盐酸盐

Ⅰ群4型禽腺病毒SDTC20株的分离鉴定与致病性研究

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畜牧与兽医 2024年第8期56卷 97-103页

作者：蔡青秀于春梅孙亚磊赵晨辰董照洋李宸辉戴建君南京农业大学动物医学院江苏南京210095 青岛蔚蓝生物股份有限公司/国家动物用保健品工程技术研究中心山东青岛266000

从山东郯城某疑似感染禽腺病毒(FAdV)的发病鸡群中采集病料并分离到1株FAdV,克隆纯化后进行PCR检测、酶切鉴定和序列分析,确定该毒株为血清4型禽腺病毒(FAdV-4),命名为SDTC20株。将该毒株接种LMH细胞增殖培养并建立了纯净稳定的种子批... 详细信息

从山东郯城某疑似感染禽腺病毒(FAdV)的发病鸡群中采集病料并分离到1株FAdV,克隆纯化后进行PCR检测、酶切鉴定和序列分析,确定该毒株为血清4型禽腺病毒(FAdV-4),命名为SDTC20株。将该毒株接种LMH细胞增殖培养并建立了纯净稳定的种子批。为探究该毒株的致病性并确定该毒株的发病标准,对SPF鸡分别进行了不同接种途径、不同攻毒剂量、不同日龄以及对42日龄SPF鸡攻毒后发病规律观察的试验。根据试验结果确定血清SDTC20株的发病标准为:用7~56日龄SPF鸡10只,每只鸡肌肉注射稀释至含10^(5.0)TCID_(50)/0.1 mL的SDTC20株病毒液0.5 mL,观察7 d,攻毒鸡出现精神不振、羽毛粗乱、缩颈蹲伏等临床症状且剖检出现心包积液或肝脏肿大、出血、发黄等病理变化判为发病,攻毒鸡应至少90%发病且至少60%死亡。提示:SDTC20株可作为Ⅰ群FAdV-4相关生物制品有效性评价的标准强毒株,为后续产品研发奠定了毒株基础。

关键词： 4型禽腺病毒分离鉴定致病性

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2024年第2期54卷 217-225页

作者：张英婕周文锋邹亚文白一涵蒋一凡湛洋王乃东杨毅杜红梅王东亮湖南农业大学动物医学院兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室/兽用疫苗逆向创制湖南省工程研究中心湖南长沙410128 湖南大学生物学院湖南长沙410012 常德市畜牧水产事务中心湖南常德415003

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体(m Ab),为PCV2免疫学诊断方法的建立和应用提供特异性抗体。首先通过原核大肠杆菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白,将纯化后的Cap蛋白在体外组装成病毒样颗粒(VLPs),以VLPs作为免疫原免疫B... 详细信息

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体(m Ab),为PCV2免疫学诊断方法的建立和应用提供特异性抗体。首先通过原核大肠杆菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白,将纯化后的Cap蛋白在体外组装成病毒样颗粒(VLPs),以VLPs作为免疫原免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤细胞技术筛选能稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,通过Western-blot和IFA方法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。采用逐步截取法合成45条覆盖PCV2 Cap蛋白全长的短肽,并通过间接ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。利用两株mAbs对人工感染PCV2的猪肺脏组织进行免疫组化(IHC)检测鉴定。结果表明,成功筛选两株识别PCV2 Cap蛋白单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为1A6和1A8,其中1A6重链为Ig G2b亚型,1A8重链为Ig G1亚型,轻链均为κ链,纯化后的抗体效价均达1∶656 100。IFA结果显示,两株mAbs均能与PCV2感染的PK-15细胞发生特异性反应;Western-blot结果显示,两株mAbs均与PCV2 Cap蛋白发生特异性反应,且不与PCV3和PCV4 Cap蛋白发生交叉反应;所获抗体均识别PCV2 Cap蛋白C端211-225 aa肽段;IHC检测结果表明,两株mAbs均能与感染PCV2的临床样品发生特异性免疫反应。本研究成功获得了两株单克隆抗体1A6和1A8,均能识别PCV2 Cap蛋白,具有良好的特异性,为PCV2免疫学诊断方法的建立及Cap蛋白生物学功能研究提供了重要生物材料。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白原核表达系统病毒样颗粒单克隆抗体

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