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冰晶调控剂对活疫苗半成品中伪狂犬病病毒效价的影响

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 757-765页

作者：赵艳红孟繁荣吕芳王军宁左晓昕揭鸿英卢宇鲍恩东南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏东泰州225300

为了解决病毒活疫苗半成品经-20℃保存后猪伪狂犬病病毒效价降低显著的问题,在伪狂犬病病毒悬液中分别添加4类不同浓度的冰晶调控剂后,经5次冻融循环后检测冻融前后病毒效价损失。结果显示,0.25 mol/L AMG、0.14 mol/L Suc、0.45 mmol/L... 详细信息

为了解决病毒活疫苗半成品经-20℃保存后猪伪狂犬病病毒效价降低显著的问题,在伪狂犬病病毒悬液中分别添加4类不同浓度的冰晶调控剂后,经5次冻融循环后检测冻融前后病毒效价损失。结果显示,0.25 mol/L AMG、0.14 mol/L Suc、0.45 mmol/L PVP、0.40 mol/L Lac组的病毒效价损失分别为0.20、0.26、0.25、0.31 lg TCID_(50)/m L;将保护效果最好的0.25 mol/L AMG与伪狂犬病病毒悬液混合,制备成活疫苗半成品在-20℃条件下保存60 d后,其病毒效价损失小于0.6 lg TCID_(50)/m L;安全性评价结果显示,0.25 mol/L AMG对小鼠、细胞无明显毒性。结果表明:病毒悬液中添加0.25 mol/L AMG经冻融循环后制备的活疫苗半成品猪伪狂犬病病毒效价损失小,且对小鼠和细胞均具有安全性,这为病毒活疫苗生产的冻干工艺优化提供了重要的理论依据。

关键词：伪狂犬病病毒活疫苗冰晶调控剂冻干工艺优化

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包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的制备及佐剂活性

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江苏农业学报 2024年第1期40卷 141-148页

作者：秦竹陈瑾侯立婷乔绪稳李兰杨利杜露平于晓明张元鹏郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品国泰技术创新中心江苏泰州225300

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得... 详细信息

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得到稳定保护。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的粒径为50~150 nm,Zeta电位约-50 mV,质量浓度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制备的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒载药率25.33%,包封率86.56%。体外模拟释放试验结果显示CTA1-DD蛋白可在7 d内缓慢释放。将CTA1-DD蛋白与PRV灭活抗原混合后,接种至小鼠鼻腔,结果表明,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒能够同时诱导更高的血清IgG抗体和黏膜IgA抗体表达,证明了其作为黏膜佐剂的高效性。

关键词： CTA1-DD蛋白 O-羧甲基壳聚糖硫酸葡聚糖纳米颗粒佐剂活性

贵州蛋鸡源高致病性FAdV-4分离株Hexon蛋白多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2024年

作者：罗东还温贵兰邓乔木朱国强徐飞赵静杨洪兴贵州大学动物科学学院贵州省动物生物制品工程技术研究中心扬州大学兽医学院

为制备反应原性良好的血清4型禽腺病毒（fowladenovirusserotype4，FAdV-4）血清学诊断抗原，本试验从在鸡肝癌细胞（LMH）上接种培养的蛋鸡源高致病性FAdV-4分离株中扩增到Hexon基因，利用同源重组技术将它连接至载体pET-30a，获得重... 详细信息

为制备反应原性良好的血清4型禽腺病毒（fowladenovirusserotype4，FAdV-4）血清学诊断抗原，本试验从在鸡肝癌细胞（LMH）上接种培养的蛋鸡源高致病性FAdV-4分离株中扩增到Hexon基因，利用同源重组技术将它连接至载体pET-30a，获得重组质粒pET-30a-Hexon，又将重组质粒转入大肠杆菌（***）BL21（DE3）感受态细胞，经异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达后纯化Hexon蛋白，进一步采用纯化后重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。结果显示，重组原核表达质粒pET-30a-Hexon经电泳和测序鉴定证明构建正确；重组蛋白Hexon以包涵体的形式被成功表达，分子质量约37ku；以制备的多克隆抗体为一抗，通过Western-blotting和间接免疫荧光（indirectedimmunofluorescenceassay，IFA）检测到LMH中的Hexon蛋白表达，表明制备的多克隆抗体能与 Hexon蛋白发生特异性反应，证明该重组蛋白具有良好的免疫原性；经间接ELISA测定，该抗体效价为 1∶2 048 000。本研究为建立FAdV-4血清学诊断技术、防控该疾病、摸索Hexon蛋白在致病过程中的作用及研制亚单位疫苗等奠定了基础。

关键词：血清4型禽腺病毒 Hexon蛋白多克隆抗体

猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

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南方农业学报 2024年第4期55卷 1238-1248页

作者：刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 详细信息

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

关键词：猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

中华绒螯蟹螺原体铁蛋白的表达、纯化和初步晶体学研究

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激光生物学报 2024年第3期33卷 227-235页

作者：杨悦王慧王锐马可徐颖张水军张珍珍陈蓉孟庆国冯志新南京师范大学海洋科学与工程学院南京210023 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学生命科学院南京210095 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体。支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异... 详细信息

铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体。支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异。目前螺原体铁蛋白还未有相关研究。本研究发现,螺原体铁蛋白与包含支原体在内的其他物种铁蛋白均具有较低的同源性。利用大肠杆菌表达中华绒螯蟹螺原体铁蛋白(SeFer),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白能以可溶的形式表达于大肠杆菌细胞内。分别通过二乙氨基乙基(DEAE)弱阴离子交换层析、分子筛层析,获得高纯度的SeFer。在4℃和18℃,用坐滴气相扩散法对SeFer进行晶体筛选,该蛋白在多种条件下能生长晶体,通过同步辐射光源衍射,其晶体最好衍射至2.90?,属于I432空间群,收集的数据可用于后继结构解析。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)、动态光散射(DLS)以及SeFer分子筛出峰位置显示,经大肠杆菌重组表达的SeFer相对分子质量为400 kD左右,粒径大小为15 nm左右,与理论值接近。利用Alphafold 2对SeFer进行结构预测,发现其具有与其他铁蛋白类似的二十面体球状结构,但是其铁氧化活性中心与支原体铁蛋白保守位点存在差异。本结果不仅为研究SeFer的晶体结构提供了基础,也为疫苗载体提供了新的候选。

关键词：中华绒螯蟹螺原体铁蛋白蛋白纯化晶体结构

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牛冠状病毒S1蛋白的真核表达及间接ELISA方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2050-2060页

作者：黄金李思远毛立蔡旭航谢玲玲王府周华李基棕李彬江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095 江苏大学生命科学学院/食品与生物工程学院镇江212013 贵州省种畜禽种质测定中心贵阳550018 黔西市动物疫病预防控制中心黔西551500 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫Hi... 详细信息

为建立一种检测牛冠状病毒(BCoV)的抗体间接ELISA检测方法,本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达BCoV的S1蛋白,并作为包被抗原,建立BCoV的S1蛋白抗体间接ELISA检测方法,应用于临床样品检测。结果显示,S1蛋白大小约100 ku,可表达于昆虫High5细胞培养基上清,经Western blot鉴定S1蛋白抗原性良好;经反应条件优化,确定抗原包被浓度为0.125μg·mL^(-1),血清稀释度为1∶200;采用1%明胶,于37℃封闭3 h;血清样品于37℃孵育30 min;酶标二抗的稀释度1∶25000,37℃孵育45 min;37℃避光显色13 min;临界值为0.297;经检验,该方法特异性良好;批间及批内变异系数均小于10%。当临界值为OD_(450 nm)为0.297时,若以IFA为标准,ELISA的敏感性为96.88%(31/32),特异性为87.50%(7/8),与IFA具有很强的一致性(κ=0.844,P研究建立的ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于BCoV的血清学调查和临床诊断,并可以应用于替代中和试验检测BCoV免疫后抗体水平。

关键词：牛冠状病毒昆虫杆状病毒表达系统 S1蛋白间接ELISA

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犬瘟热病毒检测技术研究进展

特产研究 2024年

作者：刘雅坤王晓蕾杨斐斐毕振威赵建军山东威海市荣成市城西畜牧兽医站兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院山东烟台市福山区动物卫生监督所

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）感染引起的一种热性、高度接触性传染病。CDV可感染犬科、鼬科等十几个科属的多种动物，动物感染率和死亡率为30%～80%。CD易与其它病原混合感染从而导致... 详细信息

犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）感染引起的一种热性、高度接触性传染病。CDV可感染犬科、鼬科等十几个科属的多种动物，动物感染率和死亡率为30%～80%。CD易与其它病原混合感染从而导致动物机体表现为复杂的临床症状。因此，准确、快速检测CDV感染是有效防控疫病传播的关键。本文概述了当前CDV检测技术的研究进展，主要包括CDV的病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测和其它新型检测技术，并对不同检测技术优缺点进行比较，为CD的诊断提供参考。

关键词：犬瘟热病毒检测技术免疫学分子生物学研究进展

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表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定

动物医学进展 2024年第6期45卷 44-50页

作者：章丽娇田宇杰张兰香赵冬敏韩凯凯黄欣梅杨婧吴凤瑶刘青涛刘宇卓张小飞李银江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所贵州贵阳550005 山东省日照市五莲县动物疫病预防控制中心山东五莲262300

报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 详细信息

报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。

关键词：坦布苏病毒绿色荧光蛋白报告病毒

新城疫病毒La Sota株热损伤靶点的初步分析

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中国家禽 2024年第2期46卷 59-67页

作者：曾敏倩焦嘉杰左晓昕王军宁赵艳红冯磊卢宇吕芳周斌侯继波南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300 江苏省食品质量安全重点实验室国家重点实验室培育基地江苏南京210014 江苏大学药学院江苏镇江212013

为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加... 详细信息

为探索新城疫病毒不耐热毒株La Sota热损伤靶点,以期为新型耐热疫苗研发提供理论依据,试验通过检测加热前后La Sota株的吸附及内化功能,考察纤突蛋白HN和F活性变化情况,以及核衣壳完整性,综合分析新城疫病毒热损伤靶点。结果显示:37℃加热24 h后F蛋白活性首先受损,表现为内化功能显著下降(0.01研究表明,La Sota株热损伤靶点与加热温度和时间密切相关:中温下(≤56℃)病毒热损伤靶点主要在HN和F蛋白,高温下(≥80℃)病毒热损伤靶点为纤突蛋白和核衣壳;纤突蛋白的热敏感性高于核衣壳,且F蛋白受损早于HN蛋白。

关键词：新城疫病毒 La Sota株热损伤靶点吸附内化纤突蛋白核衣壳