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生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去对称性水解合成光学纯巴氯芬的关键前体

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生物工程学报 2013年第1期29卷 31-40页

作者：徐美珍任杰龚劲松董文玥吴洽庆许正宏朱敦明江南大学医药学院制药工程研究室江苏无锡214122 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308

研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸。以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberellaintermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件... 详细信息

研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸。以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberellaintermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究。以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90%。将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee>99%。该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬。

关键词：腈水解酶 3-(4-氯苯基)-戊二腈 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸巴氯芬

基于固相微萃取箭型-气相色谱-质谱法测定铜绿微囊藻中挥发性代谢物

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分析化学 2020年第6期48卷 750-756页

作者：虞锐鹏王利平赵晨凯吴胜芳宋启军江南大学化学与材料工程学院江南大学江南大学食品科学与技术国家重点实验室

建立了顶空-固相微萃取箭型-气相色谱-质谱(HS-SPME Arrow-GC-MS)联用技术,结合多变量统计分析铜绿微囊藻在模拟自然环境条件下,其挥发性代谢物组成及变化规律。通过选取合适萃取头,对不同时期铜绿微囊藻样品中挥发性代谢物进行定性分析... 详细信息

建立了顶空-固相微萃取箭型-气相色谱-质谱(HS-SPME Arrow-GC-MS)联用技术,结合多变量统计分析铜绿微囊藻在模拟自然环境条件下,其挥发性代谢物组成及变化规律。通过选取合适萃取头,对不同时期铜绿微囊藻样品中挥发性代谢物进行定性分析,鉴定了210种挥发性代谢物。采用多变量统计分析方法,进一步研究铜绿微囊藻生长过程中挥发性代谢物的消长变化规律,筛选出10种统计学显著性差异代谢物:环己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟脑、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2, 4-癸二烯醛、吲哚、柠檬醛和正壬醇。优化了萃取温度、萃取时间、体系盐度等SPME Arrow萃取条件,筛选差异性代谢物的特征离子峰,并进行定量分析和方法学验证。结果表明,10种统计学显著性差异代谢物在0.050～1000 ng/L范围内具有良好的线性关系,相关系数>0.998,检出限范围为0.010～0.030 ng/L,回收率在76.3%～93.0%之间,RSD≤12.7%(n=6)。本方法操作简便、快速,灵敏度高,稳定性好,可用于蓝藻水华爆发初期天然水体中挥发性代谢标志物测定。

关键词：顶空-固相微萃取箭型气相色谱-质谱联用多变量统计分析铜绿微囊藻挥发性代谢物

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乳酸菌对魔芋甘露低聚糖的降解与利用

食品与发酵工业 2016年第11期42卷 20-24页

作者：王苗蒋敏李恒陆震鸣罗春勤许正宏史劲松江南大学药学院制药工程实验室江苏无锡214122 成都永安缘和生物科技有限公司四川成都611630

研究了4株乳酸菌（Lactobacillus animalis、Lactobacillus plantarum、Enterococcus faecalis及Lactobacillus reuteri）厌氧静置培养时对魔芋甘露低聚糖（konjac mannan-oligosaccharide,KMO）的降解利用情况。结果表明,Enterococcus faecalis和Lactobacillus plantarum能快速、完全地利用KMO中的DP2~3组分,Lactobacillus animalis和Lactobacillus reuteri则主要利用其中的DP2组分,且利用速率较慢。4株菌在含有KMO的培养基中生长,均能累积产生有机酸和短链脂肪酸,其中以乳酸和乙酸为主要代谢产物,但产酸能力存在差异。该研究结果可为KMO益生元产品的开发提供依据。

关键词：乳酸菌魔芋甘露低聚糖益生元短链脂肪酸

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直接发酵法生产L-丝氨酸高产菌株的选育

食品与生物技术学报 2014年第11期33卷 1191-1195页

作者：徐国强窦文芳许泓瑜张晓梅江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122

为了解除高浓度L-丝氨酸对3-磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制,进一步提高L-丝氨酸的产量,以一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-36为出发菌,经硫酸二乙酯逐级诱变处理,在D-丝氨酸抗性梯度平板上挑取正突变株,获... 详细信息

为了解除高浓度L-丝氨酸对3-磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制,进一步提高L-丝氨酸的产量,以一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-36为出发菌,经硫酸二乙酯逐级诱变处理,在D-丝氨酸抗性梯度平板上挑取正突变株,获得一株遗传性能稳定的高产菌株SYPS-062-33a-18,其可积累L-丝氨酸(11.0±0.25)g/L,较出发菌L-丝氨酸产量(6.65±0.23)g/L提高了65.4%。说明本研究不仅以D-丝氨酸作为抗性平板筛选得到高产L-丝氨酸的突变株,而且为下一步进行反向代谢工程的研究提供了良好的实验材料。

关键词：直接发酵法 L-丝氨酸高产菌株诱变育种谷氨酸棒杆菌

“那格列奈的合成与鉴定”综合性药学实验设计

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实验技术与管理 2021年第4期38卷 218-222页

作者：周莹杨丽烽张艳江南大学药学院制药工程实践教育中心江苏无锡214122

将药物的合成与结构鉴定结合起来,设计了那格列奈的合成与鉴定综合实验。通过缩合、水解反应制备得到那格列奈,利用数字熔点仪、紫外光谱仪、红外光谱仪、核磁共振仪、高分辨质谱仪等仪器对那格列奈的结构进行了解析与鉴定。该实验项目... 详细信息

将药物的合成与结构鉴定结合起来,设计了那格列奈的合成与鉴定综合实验。通过缩合、水解反应制备得到那格列奈,利用数字熔点仪、紫外光谱仪、红外光谱仪、核磁共振仪、高分辨质谱仪等仪器对那格列奈的结构进行了解析与鉴定。该实验项目涵盖知识点较多,有利于培养学生的综合科研实验素质,能够为今后的毕业设计及后续的科学研究工作创造条件。

关键词：那格列奈药物合成药物鉴别药学综合实验设计

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益生菌功能开发及其应用性能强化

科学通报 2019年第3期64卷 246-259页

作者：张娟陈坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室无锡214122

随着人们居住环境、饮食习惯和生活节奏的改变,许多新型疾病开始出现并严重威胁着人类健康.在"大健康"理念及其产业化背景下,人们的健康意识逐渐提升,而益生菌凭借其优良的益生性能受到了越来越广泛的关注.益生菌(probiotics)指可有效... 详细信息

随着人们居住环境、饮食习惯和生活节奏的改变,许多新型疾病开始出现并严重威胁着人类健康.在"大健康"理念及其产业化背景下,人们的健康意识逐渐提升,而益生菌凭借其优良的益生性能受到了越来越广泛的关注.益生菌(probiotics)指可有效增强食用者身体健康水平的活菌制剂及其代谢产物,具有改善便秘、缓解腹泻、降胆固醇、增强免疫力、预防和治疗自闭及抑郁症,抗肿瘤和保护口腔健康等功效,其主要产品益生菌膳食补充剂和益生菌非处方药等已在医药领域得到广泛应用.随着对益生菌与疾病关系研究的不断深入,益生菌在新型及重大疾病防治领域的新功能不断刷新着人类的认知.因此,学术界需进一步加强益生菌的基础研究,开发益生菌在疾病防治领域的新功能.同时,在益生菌产品的制备和应用过程中,多种严峻的环境胁迫会影响菌株正常的代谢和存活能力,抑制其益生作用的发挥.因此,利用多种手段,对其应用性能进行强化显得尤为重要.本文综述了益生菌功能开发和性能强化的主要方法和原理,概括了其在多种疾病防治过程中的应用效果,为加深对益生菌功能的认识,进一步促进益生菌产业升级提供了可借鉴的思路.

关键词：益生菌大健康菌株筛选性能强化疾病防治

钝齿棒杆菌的代谢改造:L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

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微生物学通报 2014年第10期41卷 1941-1947页

作者：赵芹芹罗玉常窦文芳张晓梅耿燕许正宏江南大学药学院制药工程研究室江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoylt... 详细信息

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。

关键词： L-鸟氨酸 L-瓜氨酸钝齿棒杆菌鸟氨酸氨甲酰转移酶 argF 精胺琥珀酸合成酶 argG

融合蛋白GGHN端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究

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生物技术通报 2013年第9期29卷 124-129页

作者：冯均尚窦文芳张晓梅许泓瑜史劲松许正宏江南大学药学院制药工程研究室无锡214122 江南大学药学院生物活性制品加工工程研究室无锡214122

GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融... 详细信息

GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH类似物的基因片段,以pPIC9K为表达质粒构建了重组表达质粒,将双酶切和测序验证正确的重组质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母GS115,然后经过MD平板筛选获得转化子,利用甲醇诱导表达72 h,SDS-PAGE检测上清产物与未修饰的GGH对比,得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液8 000 r/min离心10 min,0.45μm的微孔滤膜微滤,采用截留分子量为10 kD的超滤膜超滤20倍,再依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow、Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25层析柱。在RINm5f细胞上测cAMP的生成,通过与阳性对照的标准曲线对比发现,A-GGH活性比GGH提高10倍,表现出较好的体外活性。

关键词：融合蛋白GGH 类似物毕赤酵母表达纯化活性

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重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

微生物学通报 2017年第9期44卷 2145-2152页

作者：张旦旦窦文芳赵军史劲松许正宏江南大学药学院制药工程研究室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特... 详细信息

【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的***(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,*** SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,*** GS115也是rt PA表达的优选体系。

关键词：瑞替普酶组织纤溶酶原激活物毕赤酵母纤溶活性