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理性设计提高青霉内切多聚半乳糖醛酸酶的催化活力

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食品与发酵工业 2024年

作者：毛心怡徐岩喻晓蔚江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室江南大学工业生物技术教育部重点实验室

内切多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶中研究最为广泛的酶之一，可以特异性水解多聚半乳糖醛酸链的α-1，4-糖苷键，生成不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸，对提高果胶的附加值具有重要意义。目前关于内切多聚半乳糖醛酸酶的研究仍然较少，且其催化... 详细信息

内切多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶中研究最为广泛的酶之一，可以特异性水解多聚半乳糖醛酸链的α-1，4-糖苷键，生成不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸，对提高果胶的附加值具有重要意义。目前关于内切多聚半乳糖醛酸酶的研究仍然较少，且其催化活力和热稳定性不佳是限制其工业化应用的主要因素。课题组前期研究获得了青霉Penicillium arizonens来源的内切多聚半乳糖醛酸酶基因pePGB，并在毕赤酵母中实现了异源表达。由于其催化活力仅处于同类酶的中等水平，该研究主要针对其催化活力进行了改造。首先对其底物结合口袋亚位点的氨基酸进行了丙氨酸突变，基于突变结果及序列比对，选择了相应的突变热点进行理性设计，筛选获得了3个酶活力提高的突变体V248L、V248R和G111R，有序叠加后获得最佳突变体G111R/V248R，比活力和催化效率(kcat/Km)分别为野生型的1.84和2.06倍。随后通过同源建模及分子对接分析，248位的缬氨酸突变为精氨酸后，与底物形成了2个氢键，增强了酶与底物相互作用；而G111R突变未直接对酶与底物的相互作用造成影响，但可能与248位的精氨酸存在协同作用，共同增加了底物口袋的电正性，从而提高了与负电荷底物的结合力，进而提高了酶的催化活力。该研究为该酶后续在果汁加工等行业的应用奠定了重要基础，也为理性设计提高酶催化活力提供了参考价值。

关键词：内切多聚半乳糖醛酸酶理性设计定点突变催化活力分子对接

多萜醇磷酸β-葡萄糖基转移酶的活性和底物特异性分析

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1833-1844页

作者：栗瑞杰胡芸尚尔菲高晓冬王宁江南大学生物工程学院江苏无锡214122

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质折叠和质量控制的主要场所,其内部驻留的分子伴侣能够帮助新生多肽链形成正确的三级结构。部分分子伴侣通过特异性识别葡萄糖基化的N-寡糖结构与糖肽结合,进而促进相应蛋白的折叠。作为ER腔内... 详细信息

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质折叠和质量控制的主要场所,其内部驻留的分子伴侣能够帮助新生多肽链形成正确的三级结构。部分分子伴侣通过特异性识别葡萄糖基化的N-寡糖结构与糖肽结合,进而促进相应蛋白的折叠。作为ER腔内葡萄糖基化反应的糖基供体,体外获取多萜醇磷酸葡萄糖(dolichol phosphate glucose,Dol-P-Glc)或其类似物对解析N-寡糖生物合成途径及糖蛋白质量控制体系具有重要意义,一直受到科学家们的关注。本研究以化学合成的一系列多萜醇(dolichol)类似物作为底物,对大肠杆菌表达的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)来源的多萜醇磷酸β-葡萄糖基转移酶E(dolichyl-phosphateβ-glucosyltransferase E,Alg5E)进行了研究。结果表明该重组蛋白在体外具有较强的催化活性,可以识别不同链长的脂肪醇,底物中脂肪醇碳链越长其酶促反应进程越快,且对脂肪醇中异戊二烯的支链甲基表现出偏好性。研究还确认了重要的天冬氨酸-任意氨基酸-天冬氨酸(aspartate-anyresidue-aspartate,DXD)基序与二价金属离子的结合是该酶发挥催化功能的关键。上述工作为多萜醇寡糖(dolichol-linked oligosaccharide,DLO)合成途径中葡萄糖基转移酶Alg6、Alg8和Alg10的研究打下了基础。

关键词：葡萄糖基转移酶 N-糖基化多萜醇底物特异性

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基于文献计量的料酒研究现状分析

食品工业科技 2024年第3期45卷 378-387页

作者：贺思桥张国泰芦润青唐菁雯向琴耿敬章田洪磊陕西理工大学生物科学与工程学院陕西省资源生物重点实验室陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心秦巴生物资源与生态环境重点实验室陕西汉中723000

料酒是我国传统的调味品之一,具有日需性高、调味效果显著等特点。掌握料酒的研究现状及未来发展趋势为后续料酒研究开发提供新思路及理论依据。以文献计量(文献源:CNKI、Web of science等)及关键词分析为方法,对料酒年代发文量、国内... 详细信息

料酒是我国传统的调味品之一,具有日需性高、调味效果显著等特点。掌握料酒的研究现状及未来发展趋势为后续料酒研究开发提供新思路及理论依据。以文献计量(文献源:CNKI、Web of science等)及关键词分析为方法,对料酒年代发文量、国内核心期刊、主要作者、发文机构、专利量、研究现状等进行分析。共检索1982~2022年关于料酒研究的中英文文献130篇,专利468项。分析发现国内发文量显著高于国外;国内料酒研究发展速度缓慢;研究对象为“调味酒”、“工艺”、“风味”等呈多元化趋势,研究内容从简单理化指标的测定向功能活性机制等逐步深入。料酒研究目前处于发展阶段,基于产业升级及营养健康消费观念的改变,料酒研究应兼顾产品营养、风味与功能,本研究可为料酒产业发展提供参考。

关键词：料酒文献研究现状计量分析

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黄精对麦曲微生物群落结构及其功能基因的影响

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食品工业科技 2024年第3期45卷 56-64页

作者：张国泰贺思桥蒙倩倩芦润青唐菁雯向琴耿敬章田洪磊陕西理工大学生物科学与工程学院陕西省资源生物重点实验室陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心秦巴生物资源与生态环境重点实验室陕西汉中723000

目的:探究分别添加2.5%及5%质量分数的黄精对麦曲微生物群落结构及功能基因的影响,在此基础上为今后黄精麦曲的选择提供理论参考。方法:通过宏基因组学技术对黄精麦曲中的微生物组成及功能基因进行注释,使用主成分分析、堆叠柱状图及聚... 详细信息

目的:探究分别添加2.5%及5%质量分数的黄精对麦曲微生物群落结构及功能基因的影响,在此基础上为今后黄精麦曲的选择提供理论参考。方法:通过宏基因组学技术对黄精麦曲中的微生物组成及功能基因进行注释,使用主成分分析、堆叠柱状图及聚类热图等方法分析黄精对麦曲的微生物群落结构及功能基因的影响。结果:添加质量分数为2.5%的黄精制作的麦曲(HJ100)物种丰富度及均匀度均高于质量分数为5%(HJ200)及未添加黄精的麦曲(PTMQ);三者在属、种水平上均存在差异,其中HJ100的优势属为Aspergillus、Paecilomyces、Rasamsonia、Limosilactobacillus、Rhizopus、Klebsiella、Pantoea及Puccinia;HJ200与PTMQ的优势属均为Asper-gillus、Paecilomyces及Rasamsonia;HJ100优势种为Paecilomyces varioti、Rasamsonia emersonii、Limosilactoba-cillus pontis、Pantoea agglomerans、Rhizopus microsporus及Puccinia striiformis,HJ200与PTMQ的优势种均为Paecilomyces varioti和Rasamsonia emersonii;与HJ200及PTMQ相比,HJ100所注释出的功能基因的相对丰度展现出更高的均匀性,同时又具有高丰度的与碳水化合物代谢、蛋白质和氨基酸代谢的功能基因,该基因与黄酒的品质直接相关;酿造实验表明HJ100酿造的黄酒在总糖和多糖含量等指标上均优于HJ200及PTMQ,可保障黄酒的功能性与品质,且HJ100具有与PTMQ及HJ200相同的发酵能力。结论:添加2.5%质量分数的黄精,能够提高麦曲物种丰富度及均匀度和品质,可用于今后的黄酒酿造。

关键词：黄精麦曲宏基因组学技术功能注释微生物群落组成

大肠杆菌pepD酶对γ-氨基丁酸的催化研究

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食品与发酵工业 2024年

作者：张一维崔文璟周哲敏刘中美江南大学生物工程学院

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）广泛应用于食品和医药等领域，目前主要利用大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主菌，由酶催化方法生产。在全细胞转化过程中，GABA会进入TCA循环进行降解，导致转化率低下；通过敲基因阻碍... 详细信息

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）广泛应用于食品和医药等领域，目前主要利用大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主菌，由酶催化方法生产。在全细胞转化过程中，GABA会进入TCA循环进行降解，导致转化率低下；通过敲基因阻碍此途径又会严重影响宿主菌的生长。该研究揭示了一条新的GABA的消耗途径：GABA在胞质非特异性二肽酶（pepD）酶的作用下缩合形成二肽。我们构建了两个工程菌株：敲除E. coli BL21(DE3)基因组上的pepD基因，构建了ΔpepD菌株；在E. coli BL21(DE3)中过表达了pepD基因，构建了OEpepD菌株。以GABA和谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）为底物，进行全细胞转化反应。结果表明该酶不能催化MSG发生反应，但是能催化GABA发生反应。通过研究两个菌株消耗GABA的历程，发现OEpepD的GABA消耗量比ΔpepD菌株高出17.5%，消耗量在2 h之后都不再增加。利用LC-MS鉴定纯酶催化反应的产物，证实产物是GABA形成的二肽。该研究构建的菌株可以在不影响大肠杆菌生长的情况下有效提高GABA的产量，为GABA的工业化生产提供有益参考。

关键词： γ-氨基丁酸胞质非特异性二肽酶基因敲除

酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示乙醛脱氢酶以及检测乙醛的应用

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食品与发酵工业 2024年

作者：杜祥坤费康清王亚森白佳文中西秀树李子杰江南大学生物工程学院

乙醛是对人体有毒的化合物，乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)能将乙醛氧化为无毒的乙酸，同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H。目前检测乙醛的方法繁琐且耗时费力，该研究采用酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示Candida tropicalis ... 详细信息

乙醛是对人体有毒的化合物，乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)能将乙醛氧化为无毒的乙酸，同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H。目前检测乙醛的方法繁琐且耗时费力，该研究采用酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示Candida tropicalis LBBE-W1来源的乙醛脱氢酶，建立一种新颖快速检测乙醛的方法。首先，基于蛋白质免疫印迹与荧光结果证实ALDH能够在孢子中表达且定位在孢子壁上。然后，测定了孢子表面展示ALDH与游离ALDH的酶学性质。结果显示：孢子表面展示ALDH和游离酶的最适温度与pH值分别为40 ℃和9.0；与游离酶相比，孢子表面展示ALDH具有更高的活性，以及更佳的温度与pH稳定性。此外，孢子表面展示ALDH对十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、蛋白酶K具有更强的耐受性；孢子表面展示ALDH与游离乙醛脱氢酶的最适底物都是乙醛，并且孢子表面展示ALDH具有良好的重复使用性能。最后，将孢子表面展示ALDH作为生物传感器检测乙醛，结果表明在0～500 μmol/L的乙醛浓度范围内具有良好的线性关系，其R2值为0.999 2。该研究成功构建一种新颖的生物传感器，为乙醛的检测提供一种新的方法。

关键词：孢子表面展示乙醛脱氢酶生物传感器酿酒酵母乙醛检测

酿酒酵母孢子固定化聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的酶学性质研究

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食品与发酵工业 2024年

作者：白佳文王亚森杜祥坤佀辰钰兰周格中西秀树李子杰江南大学生物工程学院

基于酿酒酵母孢子表面展示系统，实现聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）水解酶FAST-PETase的孢子固定化。使用整合型质粒pRS306-TEF1pr-ss-FAST-PETase，将编码FAST-PETase的基因插入到酿酒酵母dit1Δ缺陷型菌... 详细信息

基于酿酒酵母孢子表面展示系统，实现聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）水解酶FAST-PETase的孢子固定化。使用整合型质粒pRS306-TEF1pr-ss-FAST-PETase，将编码FAST-PETase的基因插入到酿酒酵母dit1Δ缺陷型菌株的基因组中，使蛋白更加稳定的表达。以双-2-（羟乙基）对苯二甲酸酯[bis(2-hydroxyethyl) terephthalate，BHET]为底物，对孢子固定化FAST-PETase的最适反应条件、热稳定性、pH耐受性、洗涤剂/有机试剂耐受性和重复使用能力进行研究。孢子固定化FAST-PETase的最适反应条件为50 ℃，pH 8.0。在30～80 ℃孵育12 h后，能保留82%以上的活性。同样地，在pH 5.0～9.0孵育12 h后，也能保持78%以上的活性。与游离酶相比，孢子固定化FAST-PETase对有机试剂也有一定的抗性，在重复使用7次后仍然保留初始活性的35%。该研究利用酿酒酵母孢子表面展示系统成功实现孢子固定化FAST-PETase，并将其应用于BHET的水解中，为PET塑料的长期降解提供了新的平台。

关键词：酿酒酵母孢子表面展示 FAST-PETase BHET降解酶学性质

Ssu72磷酸酶缺失导致减数第二次分裂过程中纺锤体交叉

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遗传 2024年第6期46卷 502-508页

作者：闫静亮马玲玲渡边嘉典江南大学未来食品科学中心无锡214122 江南大学生物工程学院无锡214122

Ssu72磷酸酶是酵母裂解/多聚腺苷化因子(cleavage/polyadenylation factor,CPF)复合物的组成成分,可以催化RNA聚合酶II的C末端结构域(C-terminal domain,CTD)S5-P、S7-P的去磷酸化。后又有研究指出Ssu72磷酸酶参与有丝分裂过程中染色体... 详细信息

Ssu72磷酸酶是酵母裂解/多聚腺苷化因子(cleavage/polyadenylation factor,CPF)复合物的组成成分,可以催化RNA聚合酶II的C末端结构域(C-terminal domain,CTD)S5-P、S7-P的去磷酸化。后又有研究指出Ssu72磷酸酶参与有丝分裂过程中染色体凝聚力的调控。为进一步明确Ssu72磷酸酶是否会影响裂殖酵母减数分裂过程中染色体的分离,本研究利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记着丝粒、红色荧光蛋白标记微管蛋白Atb2,并在荧光显微镜下实时观察ssu72Δ细胞的整个减数分裂染色体分离过程。结果表明,ssu72Δ细胞在减数第二次分裂中后期发生纺锤体交叉,并且这种纺锤体的交叉产生了一种新型的孢子排布缺陷模式。本研究为高等生物中磷酸酶Ssu72的研究提供重要的借鉴意义。

关键词：裂殖酵母减数分裂 Ssu72 纺锤体交叉

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着丝粒蛋白Fta2磷酸化对减数分裂的影响

遗传 2024年第7期46卷 552-559页

作者：倪子涵闵羽马玲玲渡边嘉典江南大学未来食品科学中心无锡214122 江南大学生物工程学院无锡214122

在减数分裂过程中,黏连蛋白(cohesin)在着丝粒区域定位出现缺陷时会导致一系列疾病的产生。黏连蛋白的正确定位离不开装载复合体Mis4-Ssl3的参与,现已知黏连蛋白在装载复合体的帮助下完成装载过程,但是其如何在着丝粒区域定位仍不清楚... 详细信息

在减数分裂过程中,黏连蛋白(cohesin)在着丝粒区域定位出现缺陷时会导致一系列疾病的产生。黏连蛋白的正确定位离不开装载复合体Mis4-Ssl3的参与,现已知黏连蛋白在装载复合体的帮助下完成装载过程,但是其如何在着丝粒区域定位仍不清楚。基于已有研究报道黏连蛋白在着丝粒的定位由着丝粒蛋白的磷酸化介导,本研究从Sim4着丝粒蛋白复合体组分Fta2蛋白着手,通过生物信息学手段寻找潜在的磷酸化位点,在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中构建了fta2-9A和fta2-9D突变体,并通过噻苯咪唑(thiabendazole,TBZ)敏感度测试和荧光显微定位对其表型进行检测。结果显示,Fta2蛋白的磷酸化对有丝分裂没有影响,但对减数分裂染色体分离存在影响。本研究表明Fta2的磷酸化对减数分裂非常重要,很可能与减数分裂特有的黏连蛋白定位有关。

关键词：减数分裂黏连蛋白 Fta2 磷酸化装载复合体