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基因工程改造促进大肠杆菌发酵纤维素水解液合成1,2,4-丁三醇

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化工进展 2024年第2期43卷 1063-1068页

作者：佘丹王舒婷陆信曜宗红诸葛斌江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心江苏无锡214122

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达... 详细信息

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达四种糠醛耐受相关的基因:yghA、thyA、mdtJI和pntAB。在0.4g/L糠醛压力下,所有改造菌株的生长均有不同程度的提升,其中过表达pntAB基因的菌株生长最好,同时有助于BT合成酶的酶活力或转录水平的提高,BT产量达到11.0g/L。当以玉米芯纤维素水解液为底物时,过表达yghA、thyA和pntAB均明显促进了大肠杆菌的生长与BT产量的提高,其中yghA基因表现最好,在摇瓶中获得了3.36g/L的BT,在5L发酵罐中BT产量达到15.3g/L,转化率为63.8%。该策略为玉米芯纤维素水解液发酵生产BT提供了借鉴。

关键词：大肠杆菌玉米芯纤维素水解液糠醛耐受 1 2 4-丁三醇

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多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

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应用与环境生物学报 2024年第1期30卷 167-175页

作者：郭艺鸣姜君逸潘学玮张显徐美娟杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇... 详细信息

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

关键词：多酶级联转化辅酶循环再生 γ-丁内酯 1,4-丁二醇

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代谢工程改造热带假丝酵母生产鼠尾草酸

食品与发酵工业 2024年第3期50卷 45-51,I0002,I0003页

作者：霍达陈献忠杨海泉曹钰江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

鼠尾草酸(carnosic acid,CA)是一种酚类二萜化合物,广泛存在于鼠尾草等唇科类植物中。CA具有抗肿瘤等多种生理以及药理活性,在日化、食品、医疗领域应用价值巨大。热带假丝酵母具有鲁棒性强、耐高温、产油脂等特性,因而在萜类化合物高... 详细信息

鼠尾草酸(carnosic acid,CA)是一种酚类二萜化合物,广泛存在于鼠尾草等唇科类植物中。CA具有抗肿瘤等多种生理以及药理活性,在日化、食品、医疗领域应用价值巨大。热带假丝酵母具有鲁棒性强、耐高温、产油脂等特性,因而在萜类化合物高效生产方面极具潜力。该研究根据热带假丝酵母密码子偏好性对来源于鼠尾草的铁锈醇合酶基因CYP76AH24和鼠尾草酸合酶基因CYP76AK6、来源于拟南芥的细胞色素还原酶基因ATR1进行全序列密码子优化以及基因合成。以生产鼠尾草酸前体次丹参酮二烯热带假丝酵母1C2PM04作为出发菌株,将上述基因整合到其基因组中成功合成鼠尾草酸。利用模块化工程与酵母不同亚细胞区室的空间组合,将上述3条基因以模块化的方式导入胞质和过氧化物酶体中进行表达,鼠尾草酸产量分别为10.25 mg/L和4.64 mg/L。通过下调角鲨烯合酶基因ERG9,降低法尼基焦磷酸池的消耗进而改变代谢通量进一步提高鼠尾草酸产量,效价达到26.3 mg/L。将细胞色素P450酶和细胞色素还原酶进行融合表达,测试以刚性linker(E3AK,E3AK×2,E3AK×3)和柔性linker(G4S,G4S×2,G4S×3)为连接肽,融合表达CYP76AH24和ATR1,鼠尾草酸产量提高1.54倍。该文通过增加CPR拷贝数,增加电子供体,进一步提高鼠尾草酸表达水平,产量达到78.24 mg/L。

关键词：热带假丝酵母鼠尾草酸细胞色素P450 融合蛋白代谢工程

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代谢工程改造酿酒酵母高效合成游离脂肪酸

食品与发酵工业 2024年第2期50卷 15-22页

作者：朱满志陈献忠沈微杨海泉夏媛媛江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

该文以酿酒酵母BY4741作为底盘细胞,通过系统代谢工程改造提高游离脂肪酸(free fatty acid,FFAs)的合成。首先,通过删除酰基CoA合成酶FAA1、FAA4以及FAT1的编码基因,提高FFAs的合成,酵母工程菌株FFAs达到384.4 mg/L。进一步,通过敲除PO... 详细信息

该文以酿酒酵母BY4741作为底盘细胞,通过系统代谢工程改造提高游离脂肪酸(free fatty acid,FFAs)的合成。首先,通过删除酰基CoA合成酶FAA1、FAA4以及FAT1的编码基因,提高FFAs的合成,酵母工程菌株FFAs达到384.4 mg/L。进一步,通过敲除POX 1、FAA 2和PXA 2基因,破坏了酵母细胞的β-氧化途径,使细胞外FFAs进一步提高,达到了394.9 mg/L。随后,通过敲除磷脂酸磷酸酶编码基因DPP 1,LPP 1,PAH 1,降低了磷脂酸(phosphatidic acid,PA)的去磷酸化水平,上调了获得的多基因缺失的酵母工程菌(Δfaa 1Δfaa4Δfat1Δpox1Δfaa2Δpxa2Δdpp1Δlpp1Δpah1)能够产生497.3 mg/L的细胞外游离脂肪酸,以及1332.2 mg/L的总脂肪酸。通过组合代谢工程产生的平台菌株,为未来发展脂质相关的细胞工厂提供了基础。

关键词：游离脂肪酸 β氧化酿酒酵母磷脂酸酰基CoA

Amycolatopsis sp.的全基因组测序及香兰素合成途径分析

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食品与发酵工业 2024年第4期50卷 25-30页

作者：王冠娜郑义培郑璞江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)CCTCC NO:M2011265是一株可以转化阿魏酸生成香兰素菌株,该研究利用Illumina Hiseq测序平台对拟无枝酸菌进行全基因组测序、拼接、基因预测及功能注释,并从拟无枝酸菌的全基因组中筛选和鉴定参与香兰素合... 详细信息

拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)CCTCC NO:M2011265是一株可以转化阿魏酸生成香兰素菌株,该研究利用Illumina Hiseq测序平台对拟无枝酸菌进行全基因组测序、拼接、基因预测及功能注释,并从拟无枝酸菌的全基因组中筛选和鉴定参与香兰素合成的功能基因。结果表明,总共组装得到64个scaffolds,整个基因组组装大小约为8425551 bp,总GC含量为71.89%。通过生物信息学分析发现了香兰素合成关键基因ech、fcs和ech2基因,及香兰素分解代谢基因vdh基因,其中ech和fcs为一个基因簇,并进一步构建过表达ech-fcs-ech2菌株,其摇瓶发酵表明转化阿魏酸生成香兰素速率加快,发酵时间显著缩短。该研究获得的拟无枝酸菌的全基因组信息为解析其转化阿魏酸生成香兰素发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础,也为通过代谢工程获得高产香兰素菌株的研究提供理论支持。

关键词：香兰素拟无枝酸菌全基因组测序阿魏酸基因功能注释

岩藻多糖酶产生菌的筛选及其酶解产物的结构表征、抗氧化研究

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食品与发酵工业 2024年第1期50卷 22-28页

作者：杨柳顾秋亚王聪聪李熙文余晓斌江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

该文以唯一碳源法初筛,并以高效凝胶渗透色谱法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)检测,从茶叶中得到一株具有岩藻多糖酶活性的菌株。利用该菌发酵粗酶液在50℃下酶解岩藻多糖(fucoidan,F)24 h后,产物中低于10 kD... 详细信息

该文以唯一碳源法初筛,并以高效凝胶渗透色谱法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)检测,从茶叶中得到一株具有岩藻多糖酶活性的菌株。利用该菌发酵粗酶液在50℃下酶解岩藻多糖(fucoidan,F)24 h后,产物中低于10 kDa的低分子质量岩藻多糖(low molecular weight fucoidan,LMWF)相对含量为59.4%。基于ITS基因序列的系统发育分析,该菌株被鉴定为Aspergillus amstelodami。后用该菌株的发酵粗酶液酶解制备LMWF,分析F和LMWF的硫酸基团含量、单糖组成、分子质量和糖苷键类型;结果表示,F、LMWF硫酸基团含量分别为(33.0±0.3)%、(32.4±0.9)%;单糖主要由岩藻糖和半乳糖组成,并含有少量的木糖和葡萄糖醛酸;分子质量分别为277 kDa、2997 Da;糖苷键类型均为α-糖苷键。水解前后样品的抗氧化结果显示,LMWF的抗氧化活性明显优于F;表明利用该菌发酵粗酶液酶解制备的LMWF具有较好的生物活性,研究结果为后续岩藻多糖应用于食品与工业化生产奠定了基础。

关键词：筛选鉴定低分子质量岩藻多糖结构表征抗氧化

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鼠李糖修饰增强曲妥珠单抗的Fc效应功能

中国生物工程杂志 2024年第5期44卷 1-9页

作者：洪皓飞赵洁李艳春李丹吴志猛江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡214122

目的:探讨鼠李糖(rhamnose,Rha)修饰对曲妥珠单抗(trastuzumab,Tra)Fc效应功能的影响。方法:将二硫键还原的Tra分子与含交联剂的Rha衍生物分子偶联,构建Tra-Rha偶联物。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和高效液相分子排阻色谱对偶联... 详细信息

目的:探讨鼠李糖(rhamnose,Rha)修饰对曲妥珠单抗(trastuzumab,Tra)Fc效应功能的影响。方法:将二硫键还原的Tra分子与含交联剂的Rha衍生物分子偶联,构建Tra-Rha偶联物。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和高效液相分子排阻色谱对偶联物进行表征,并通过流式细胞术评估偶联物的HER2抗原亲和水平,免疫荧光和流式细胞术评估偶联物的抗Rha抗体募集能力。最后,通过在体外检测偶联物介导的补体依赖的细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖细胞介导的吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP),评估其Fc效应功能的增强水平。结果:成功构建了一款Tra-Rha偶联物。亲和实验和抗体募集实验表明Tra-Rha偶联物保留了良好的HER2抗原结合能力,并能将高水平抗Rha抗体选择性募集至靶细胞表面。CDC实验显示,Tra-Rha偶联物可介导显著的CDC效应对HER2阳性的SKBR3和SKOV3细胞进行杀伤,最高杀伤率分别为75%和70%,而相同条件下未修饰Rha的Tra则不能介导CDC。ADCP实验则显示,在SKBR3和SKOV3细胞中,Tra-Rha介导的ADCP水平较Tra分别提高了2.3倍和1.2倍。结论:Rha修饰可作为一种经济高效的策略,用于同时增强Tra的多种Fc效应功能,进而改善Tra的治疗指数。

关键词：曲妥珠单抗 HER2 鼠李糖 Fc效应功能

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芳香杂环酮还原酶的基因挖掘及催化性质

微生物学通报 2024年

作者：薛佳钰许国超倪晔江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

【背景】(R，S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙醇(NEB-8(R，S))是奈必洛尔的重要手性中间体，由芳香杂环酮还原酶不对称合成。而目前的天然酮还原酶催化效率低，对映选择性差，商业酮还原酶来源不明确，反应转化率低... 详细信息

【背景】(R，S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙醇(NEB-8(R，S))是奈必洛尔的重要手性中间体，由芳香杂环酮还原酶不对称合成。而目前的天然酮还原酶催化效率低，对映选择性差，商业酮还原酶来源不明确，反应转化率低。【目的】研究具有高对映选择性、稳定性良好、催化效率优异的酮还原酶实现NEB-8(R，S)的高效不对称合成。【方法】基于已有的酮还原酶的蛋白质序列，通过基因挖掘，获得了来源于玫瑰谦虚杆菌（Modestobacter roseus）的酮还原酶基因mradh，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达，测定其对映选择性，表征其酶学性质，并优化它在高浓度底物下的反应。【结果】论文筛选获得了一种新型酮还原酶MrADH，其属于中链醇脱氢酶超家族，兼具氧化和还原能力。MrADH的氧化、还原活性的最适pH值分别为9.5和7.0；对于酮酯类底物、间位取代芳香酮、杂环酮和仲醇等底物，MrADH具有良好的还原氧化活性；此外，在40 ℃条件下，MrADH半衰期可长达207 h，显示出良好的热稳定性。MrADH能够高效地催化还原600 mmol/L的(S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙酮，以接近100%的对映体过量（ee）和99.7%的转化率合成产物醇。【结论】来源于M. roseus的酮还原酶可以高效合成高光学纯度的盐酸奈必洛尔中间体，为奈必洛尔的合成奠定了基础。

关键词：基因挖掘芳香杂环酮还原酶高立体选择性 MrADH 奈必洛尔

分子改造甲烷八叠球菌醇脱氢酶催化合成4-羟基-2-丁酮

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应用与环境生物学报 2024年

作者：张笛张恒维张迪杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍... 详细信息

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍生物。首先克隆表征了一种甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)来源的醇脱氢酶(MeADH)，研究发现，其可用于催化1，3-BDO合成4H2B。MeADH最适催化温度为60 ℃，最适催化pH为10.0。经酶学性质分析发现，MeADH在最适反应温度60 ℃下孵育48 h仅剩7.51%左右残余酶活力，说明其热稳定性不佳。基于计算机辅助设计选择了15个突变位点，筛选得到一个双突变MeADHE246P/T296P，在60 ℃条件下孵育48 h，其残余酶活为初始酶活的40.27%左右，比原始酶提高了5.36倍。此外，MeADH催化反应过程中需要辅酶NADP+，本文通过引入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)来源的NADH氧化酶(LrNox)突变体LrNoxL179S构建了NADP+辅酶循环体系，并将其应用到4H2B的生物合成中。通过优化反应条件和底物流加实验，4H2B合成量最高达到2.2 g/L左右，为后续进行高效生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物的研究奠定了基础。(图10 表3 参29)

关键词： 4-羟基-2-丁酮醇脱氢酶辅酶循环再生热稳定性