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脑源性神经营养因子对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响

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中华创伤杂志 2011年第1期27卷 68-71页

作者：张赛刘晓智孙洪涛涂悦程世翔武警医学院附属医院脑创伤与神经疾病研究所、脑系科中心天津300162

目的研究脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响.方法脂质体介导BDNF表达质粒转染293T细胞,ELISA法确定BDNF高峰表达时相,收集高表达时相阶段细胞上清液.建立SD... 详细信息

目的研究脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）对亚低温处理后移植干细胞的存活及分化的影响.方法脂质体介导BDNF表达质粒转染293T细胞,ELISA法确定BDNF高峰表达时相,收集高表达时相阶段细胞上清液.建立SD大鼠液压脑创伤模型,分为A组（干细胞移植组）和B组（干细胞移植＋BDNF组）,两组同时给予亚低温治疗（33℃）5 d.对第4天和第8大（复温后第3天）脑组织标本行增殖细胞核抗原（PCNA）、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组织化学及原位细胞凋亡检测,实验动物予以神经功能缺陷评分.结果 ELISA结果显示细胞转染48～60 h后BDNF持续高表达.亚低温处理第4天两组PCNA、巢蛋白均高表达,NSE及GFAP无或极低表达,细胞凋亡少见,但B组较A组更少（P＜0.05）.复温后第3天两组PCNA、巢蛋白均表达下降,NSE及GFAP表达升高,但B组较A组NSE阳性率更高,细胞凋亡更少（P＜0.05）.B组获得最佳动物神经功能评分.结论 BDNF可增加低温环境下的干细胞存活率,并诱导干细胞向神经元分化.

关键词：颅脑损伤干细胞脑源性神经营养因子亚低温

MRI-三维重建动态测量颅脑创伤模型大鼠的空腔变化

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中国组织工程研究 2016年第40期20卷 5946-5952页

作者：符锋赵明亮李晓红陈翀王丽娜孙洪涛涂悦张赛脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院脑科医院天津市神经创伤修复重点实验室天津市300162

背景:目前针对颅脑创伤后空腔的研究工作大多采用尸体标本或者针对实验动物取材后进行观察,无法实现动态评估空腔变化。目的:探讨三维重建在颅脑创伤预后评估中的应用效果。方法:取5只雄性SD大鼠,使用电子脑皮质挫伤撞击仪制备颅脑创伤... 详细信息

背景:目前针对颅脑创伤后空腔的研究工作大多采用尸体标本或者针对实验动物取材后进行观察,无法实现动态评估空腔变化。目的:探讨三维重建在颅脑创伤预后评估中的应用效果。方法:取5只雄性SD大鼠,使用电子脑皮质挫伤撞击仪制备颅脑创伤模型,分别于造模后第1天、第1个月、第2个月和第3个月获取大鼠颅脑MRI扫描数据,应用Mimics16.0软件重建颅脑创伤后空腔三维模型,在Meshmixer软件中分析颅脑创伤后空腔变化情况。结果与结论:(1)重建模型图像轮廓清晰,均能从不同侧面和视角进行颅脑创伤空腔的观察和测量;(2)颅脑创伤后不同时间点的空腔体积及空腔表面积,除了第2个月与第3个月差异无显著性意义外(P>0.05),其他各个时间点之间两两比较差异均有显著性意义;(3)空腔变化结果提示,颅脑创伤后第3个月空腔形状逐渐规则;(4)基于MRI扫描数据,结合三维重建软件Mimics与模型分析软件Meshmixer,可方便、快捷地获取空腔模型,为动态评估颅脑创伤后空腔变化提供一种直观的方法。

关键词：实验动物神经损伤与修复动物模型三维重建核磁共振 Mimics 颅脑创伤动态测量空腔 Meshmixer Dicom 体积表面积国家自然科学基金

ts—SV40LT抗原转基因干细胞增殖活性的温度调控机制分析

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中华神经外科杂志 2010年第6期26卷 557-561页

作者：涂悦刘晓智张赛武警医学院附属医院脑创伤与神经疾病研究所天津300162

目的研究温度敏感性猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）转基因干细胞增殖活性的温度调控机制,为实现脑创伤患者在亚低温治疗期间实施干细胞移植奠定基础.方法用含ts-SV40LT抗原的表达质粒转染人源性脐带间充质干细胞（UCMSCs）,PCR方法 ... 详细信息

目的研究温度敏感性猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）转基因干细胞增殖活性的温度调控机制,为实现脑创伤患者在亚低温治疗期间实施干细胞移植奠定基础.方法用含ts-SV40LT抗原的表达质粒转染人源性脐带间充质干细胞（UCMSCs）,PCR方法检测外源基因的整合效率,将其分别置于亚低温（33℃）和正常体温（37℃）下培养,细胞免疫荧光方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）活性,PCR-ELISA端粒酶检测法检测端粒酶活性,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测细胞周期调控蛋白--周期素D1（Cyclin D1）、CyclinE、周期素依赖性蛋白激酶-2（CDK2）、CDK4、CDK6、P16和P21的蛋白表达情况,免疫荧光方法检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达;SPSS13.0软件进行统计学分析.结果 PCR结果显示ts-SV40LT抗原的基因片段被成功整合入干细胞,该细胞株在33℃条件下增殖生长旺盛,端粒酶活性高,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6均高表达,P16和P21低表达,同时高表达nestin,不表达NSE和GFAP;在37℃条件下细胞增殖缓慢甚至停滞,端粒酶活性低,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6的表达强度明显低于33℃条件,P16和P21则相反,与此同时nestin表达强度明显下降,NSE和GFAP表达水平上升.结论通过ts-SV40LT抗原基因的有效转染可实现干细胞在不同温度环境下的增殖调控,为在亚低温条件下实现干细胞移植救治颅脑创伤患者提供了实验支持.

关键词：干细胞颅脑创伤低温疗法分化

重型颅脑创伤亚低温治疗中脑组织氧分压持续监测的应用

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中华神经外科杂志 2012年第2期28卷 141-144页

作者：孙洪涛程世翔涂悦吴焕成李兆麟张赛武警部队脑创伤与神经疾病研究所、武警医学院附属医院脑系科中心天津300162

目的研究亚低温治疗状态下重型颅脑创伤（sTBI）患者伤后早期脑组织氧分压（PbtO2）的动态变化及临床意义。方法38例sTBI患者进行亚低温治疗，连续监测PbtO2、颈静脉血氧饱和度（SjvO2）、颅内压（ICP）、和脑灌注压（CPP）等指标，对... 详细信息

目的研究亚低温治疗状态下重型颅脑创伤（sTBI）患者伤后早期脑组织氧分压（PbtO2）的动态变化及临床意义。方法38例sTBI患者进行亚低温治疗，连续监测PbtO2、颈静脉血氧饱和度（SjvO2）、颅内压（ICP）、和脑灌注压（CPP）等指标，对监测结果以及PbtO2和其他指标相关性进行分析，并记录患者伤后3个月的格拉斯哥预后评分。结果在亚低温治疗初期，患者PbtO2、SjvO2和CPP明显上升，ICP明显下降，而治疗36h和48h后PbtO2及SjvO2无明显变化。亚低温治疗后ICP较治疗前明显下降，低PbtO2隋况明显改善，ICP和PbtO2之间呈负相关；PbtO2及SjvO2水平明显上升，PbtO2与SjvO2呈直线正相关；PbtO2与CPP呈直线正相关。监测过程中，在SjvO2和CPP水平正常的情况下，仍有较大比例的患者出现低PbtO2隋况。治疗过程中没有出现过低PbtO2水平的患者预后良好。结论PbtO2是监测sTBI患者局部脑组织氧合的一项重要指标，具有很高敏感性，对于指导治疗和判断预后具有重要意义，而亚低温能够明显改善PbtO2降低的情况。

关键词：外伤性脑损伤亚低温脑组织氧分压

十二井穴刺络放血联合亚低温治疗对颅脑创伤急性期大鼠脑水肿的影响

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中国应用生理学杂志 2015年第3期31卷 249-253页

作者：苗笑梅程世翔杨震张赛韩宛君涂悦孙洪涛天津中医药大学天津300193 天津市神经创伤修复重点实验室、武警脑创伤与神经疾病研究所、武警后勤学院附属医院脑科医院天津300162

目的:探讨十二井穴刺络放血联合亚低温对颅脑创伤(TBI)大鼠急性期脑水肿的影响。方法:将75只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组(n=15):假手术组(Sham)、颅脑创伤组(TBI)、放血组(BL)、亚低温组(MIH)、放血联合亚低温组(BL+MIH)。采用电子... 详细信息

目的:探讨十二井穴刺络放血联合亚低温对颅脑创伤(TBI)大鼠急性期脑水肿的影响。方法:将75只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组(n=15):假手术组(Sham)、颅脑创伤组(TBI)、放血组(BL)、亚低温组(MIH)、放血联合亚低温组(BL+MIH)。采用电子脑皮质损伤撞击仪(eCCI)建立大鼠TBI模型,BL组于伤后即刻行十二井穴刺络放血,每日2次;MIH组在伤后即刻采用亚低温冰毯使体温降至32℃,持续干预6 h。伤后48 h分别采用核磁共振成像技术(MRI)观察脑水肿变化(n=3)、神经功能缺损评分(m NSS)观察行为学改变及干/湿重法测定脑含水量(n=8)、伊文思蓝染色(EB)检测血脑屏障通透性(BBB)(n=4)。结果:MRI显示,TBI组脑水肿及血肿明显,中线明显偏移;而干预组较TBI组水肿明显减轻,中线居中。与TBI组比较,各干预组m NSS评分均明显改善(P脑含水量也有不同程度降低(P脑屏障通透性均有明显改善(均P神经功能缺陷评分,减轻脑水肿,降低血脑屏障通透性,对创伤性大鼠脑组织有保护作用,且二者联合治疗效果更加明显。

关键词：十二井穴亚低温颅脑创伤脑水肿放血大鼠

控制性脑皮质撞击致不同损伤程度颅脑创伤大鼠模型的建立

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中华行为医学与脑科学杂志 2014年第10期23卷 865-868页

作者：程世翔张海博陈旭义涂悦张赛武警部队脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院脑科医院天津市神经创伤修复重点实验室天津300162

目的应用控制性脑皮质撞击仪（CCI）建立不同损伤程度的颅脑创伤（TBI）大鼠模型,为探索TBI病理生理进程提供实验依据.方法 40只雄性Wistar大鼠按数字表随机分为4组（3组实验组、1组假手术组）,每组10只.应用电子控制性皮质撞击仪（eCC... 详细信息

目的应用控制性脑皮质撞击仪（CCI）建立不同损伤程度的颅脑创伤（TBI）大鼠模型,为探索TBI病理生理进程提供实验依据.方法 40只雄性Wistar大鼠按数字表随机分为4组（3组实验组、1组假手术组）,每组10只.应用电子控制性皮质撞击仪（eCCI-6.3）,设定不同打击参数,对大鼠顶叶大脑皮质区进行精确撞击.其中,实验组打击速率分别为4 m/s、5m/s、6m/s,打击时间均为200 ms,打击深度均为2 mm.假手术组仅开骨窗不行撞击.致伤24 h后采用神经功能缺陷评分（NSS）观察大鼠行为学改变,应用多普勒流量计测定大鼠脑损伤周围区域局部脑血流（rCBF）.致伤48 h后处死大鼠,取脑组织行甲苯胺蓝染色观察脑组织缺损程度,HE染色评估脑组织病理学改变,透射电镜观察神经细胞超微结构.结果大鼠脑损伤程度与打击强度相关,打击速率4m/s模拟轻度TBI、5m/s模拟中度TBI、6m/s模拟重度TBI.与假手术组比较,TBI各组大鼠神经功能受损,局部脑血流量降低（均P＜0.01）,脑组织神经元皱缩、细胞周围空泡、线粒体结构异常,而且损伤程度随打击速率增强而递增,组间差异有统计学意义（P＜0.05）.结论应用eCCI脑皮质撞击仪成功建立TBI大鼠模型,通过调整打击速率给予轻度、中度和重度TBI分级,为进一步研究TBI病理生理机制提供了一种精确有效的TBI动物模型制作方法.

关键词：颅脑创伤控制性脑皮质撞击动物模型大鼠

活性因子对大鼠创伤性脑损伤后内源性神经干细胞增殖和分化的影响

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中华创伤杂志 2016年第9期32卷 843-847页

作者：任登鹏李晓红涂悦孙洪涛王景景王丽娜陈翀栾佐张赛天津医科大学研究生院 300070 武警后勤学院附属医院脑科医院脑创伤与神经疾病研究所海军总医院儿科

目的探讨活性因子对大鼠创伤性脑损伤（TBI）后海马齿状回颗粒下区神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（只暴露硬脑膜，不接受液压冲击）、活性因子组（假手术大鼠给予活性因子治疗）、TBI组... 详细信息

目的探讨活性因子对大鼠创伤性脑损伤（TBI）后海马齿状回颗粒下区神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组（只暴露硬脑膜，不接受液压冲击）、活性因子组（假手术大鼠给予活性因子治疗）、TBI组[采用液压冲击仪（2．5atm）建立大鼠单侧重型TBI模型]和TBI＋活性因子组（TBI后即刻对侧脑室穿刺并注射活性因子治疗），每组10只大鼠。TBI后7d，40g／L多聚甲醛灌流取材切片或断头取损伤侧海马匀浆，采用免疫荧光染色法检测海马齿状回颗粒下区溴化脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）和神经元核抗原（NeuN）的表达，选用连续5张切片进行阳性细胞计数，采用Westernblot检测海马区核转录因子-KB（NF—KB）p65蛋白的表达量。结果与假手术组比较，TBI组伤后7d海马齿状回颗粒下区BrdU＋和NeuN＋细胞数显著增加（P〈0．05）。与TBI组比较，TBI＋活性因子组BrdU＋和NeuN＋细胞明显增加[（207．7±22．5）：（115．9±13．3）]（P〈0．05）。而假手术组和活性因子组BrdU＋和NeuN＋细胞数差异无统计学意义（P〉0．05）。与假手术组比较，TBI组伤后7d海马区NF—KBp65表达增强，而TBI＋活性因子组减弱[（0．81±0．09）：（1．46±0．13）]（P〈0．05），但假手术组和活性因子组海马区NF—KBp65表达无明显变化。结论活性因子可促进大鼠TBI后海马齿状回颗粒下区神经干细胞的增殖和神经元分化，可能与激发神经元生成及降低TBI后海马区NF—KBp65的表达有关。

关键词：颅脑创伤神经干细胞活性因子

胶原/壳聚糖复合支架植入大鼠不同部位降解速率的变化

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中国组织工程研究 2017年第6期21卷 864-870页

作者：符锋秦喆李晓红陈翀王丽娜徐超涂悦张赛脑创伤与神经疾病研究所、式警后勤学院附属医院脑科中心、天津市神经创伤修复重点实验室天津市300162 武警后勤学院中心实验室天津市300162

背景:生物支架应随着新生组织的形成而逐渐降解,支架降解率是评价材料的一项重要指标。传统测试方法因存在一定限制而会影响对材料在不同部位降解率的评估。目的:评估胶原壳聚糖复合支架植入SD大鼠皮下、脊髓和脑组织的降解率,并初步探... 详细信息

背景:生物支架应随着新生组织的形成而逐渐降解,支架降解率是评价材料的一项重要指标。传统测试方法因存在一定限制而会影响对材料在不同部位降解率的评估。目的:评估胶原壳聚糖复合支架植入SD大鼠皮下、脊髓和脑组织的降解率,并初步探讨其机制。方法:制备3 mm×3 mm圆盘状胶原壳聚糖复合支架,通过扫描电子显微镜观测支架微观结构,对其主要的物理学特性进行测试;CCK-8法检测神经干细胞与支架共培养时的活力以评估支架生物相容性。将SD大鼠随机分为大脑组、脊髓组及皮下组,分别于脑皮质、脊髓T9处、背部T9皮下处植入胶原壳聚糖复合支架。于不同时间点灌注取材,每组3只大鼠取出支架称质量,评估支架体内降解率;组内其他大鼠用于制备组织切片,观察移植区支架与周围组织的组织学变化。结果与结论:1扫描电镜发现,胶原壳聚糖复合支架具有立体多孔结构,孔径大小能达到体内移植的生物学要求;2体内实验结果表明,植入胶原壳聚糖复合支架后未发生排斥反应,证明复合材料具有良好的生物相容性。皮下组降解速率最快,12 d即可降解完全,明显高于脊髓组和大脑组(P脑组(P脑组仍有部分残余;3皮下组的支架周围血管数量和巨噬细胞浸润定性评分大于同一时间点的其他2组(P脑组(P<0.05);4结果说明,胶原/壳聚糖支架具有良好的生物相容性,在3个组织内的降解速率存在明显差异。组织工程学领域中平衡生物支架的降解率与人体重建速度时,应考虑靶向组织复杂的微环境和支架移植后的宿主反应的具体机制。

关键词：组织工程生物相容性材料脊髓生物材料材料相容性可降解吸收材料胶原壳聚糖不同部位大脑皮下降解率大鼠国家自然科学基金

亚低温对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响

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中国应用生理学杂志 2016年第4期32卷 289-292,I0001-I0003页

作者：康文博李晓红陈翀王景景涂悦张赛梁海乾武警后勤学院附属医院脑科医院脑创伤与神经疾病研究所天津市神经创伤修复重点实验室天津300162 河北医科大学石家庄050017

目的:观察在不同温度条件下脊髓星形胶质细胞划痕损伤活化后的形态和活性改变,以探讨亚低温对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响。方法:体外原代培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,以划痕实验制备反应性星形胶质细胞。亚低温选择33... 详细信息

目的:观察在不同温度条件下脊髓星形胶质细胞划痕损伤活化后的形态和活性改变,以探讨亚低温对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生的影响。方法:体外原代培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,以划痕实验制备反应性星形胶质细胞。亚低温选择33℃,细胞培养48 h。实验分为对照组、划痕组、亚低温组和划痕+亚低温组。各组在相应的时间点观察细胞形态,采用免疫荧光染色方法检测Nestin阳性率,MTT比色法观察细胞活性,PI染色方法观察细胞凋亡程度。结果:与对照组和亚低温组相比,划痕组和划痕+亚低温组细胞胞体肥大,周围突起增多、延展以及胞浆丰富,细胞生长率明显升高。与划痕组相比,划痕+亚低温组细胞变化减慢,周围突起减少,细胞长入划痕处所需时间增加,细胞Nestin阳性率、PI阳性率和细胞生长率明显降低,各结果差异显著(P<0.01)。结论:划痕损伤后星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞并会增生,亚低温明显抑制脊髓反应性星形胶质细胞的活化增生,并可以抑制星形胶质细胞的凋亡。

关键词：亚低温反应性星形胶质细胞脊髓损伤大鼠