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胚胎胎SD大鼠神经干细胞原代培养及分化鉴定的实验研究

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武警后勤学院学报（医学版） 2016年第5期25卷 337-340,F0002页

作者：张仁坤李晓红陈星陈彦婷涂悦张赛武警后勤学院附属医院脑科医院天津市神经创伤修复重点实验室天津300162

【目的】建立胚胎SD大鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）原代培养的方法,免疫荧光鉴定其纯度和分化潜能。【方法】取孕14 d的SD大鼠,麻醉消毒后分离胎鼠大脑海马组织,研磨并胰酶消化后离心,计数后分瓶培养,倒置显微镜下观察神经... 详细信息

【目的】建立胚胎SD大鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）原代培养的方法,免疫荧光鉴定其纯度和分化潜能。【方法】取孕14 d的SD大鼠,麻醉消毒后分离胎鼠大脑海马组织,研磨并胰酶消化后离心,计数后分瓶培养,倒置显微镜下观察神经干细胞生长情况。当神经球直径100～150μm时,胰酶消化后计数传代培养。取第3代神经干细胞行巢蛋白免疫荧光染色鉴定其纯度。将第3代神经干细胞消化计数后种植于预铺多聚赖氨酸的培养板中,7 d后行微管相关蛋白2（microtubulinassociated protein 2,MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）免疫荧光染色鉴定其分化潜能。【结果】显微镜下可见神经干细胞生长良好,增殖迅速,7 d左右可形成直径大小为150μm的神经球,细胞透光度好。第3代神经干细胞经免疫荧光染色证实纯度95%以上。分化鉴定实验可见MAP2、GFAP和MBP阳性细胞。【结论】成功建立胚胎SD大鼠神经干细胞原代培养方法,细胞状态好、纯度高。神经干细胞有多样分化潜能,可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,为神经系统损伤修复和退变性疾病的细胞替代治疗提供了实验基础。

关键词：神经干细胞原代培养免疫荧光分化

十二井穴刺络放血联合薏苡仁对颅脑创伤性脑水肿作用的研究进展

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天津中医药 2016年第9期33卷 573-576页

作者：苗笑梅程世翔孙洪涛王景景涂悦天津中医药大学天津300193 天津市神经创伤修复重点实验室武警脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院脑科医院天津300162

十二井穴刺络放血和中药薏苡仁已被广泛应用于临床治疗,两者单独应用也取得不同程度的临床疗效,但对于他们联合应用治疗颅脑损伤的机制及治疗效果的研究报道少之又少。文章查阅了大量文献,总结出十二井穴刺络放血对颅脑创伤性昏迷患者... 详细信息

十二井穴刺络放血和中药薏苡仁已被广泛应用于临床治疗,两者单独应用也取得不同程度的临床疗效,但对于他们联合应用治疗颅脑损伤的机制及治疗效果的研究报道少之又少。文章查阅了大量文献,总结出十二井穴刺络放血对颅脑创伤性昏迷患者的醒脑开窍作用和通过调节氢离子(H^+)、钾离子(K^+)、钠离子(Na^+)、钙离子(Ca^(2+))等离子而达到减轻脑水肿及神经保护作用的中西医理论依据,并且阐述了薏苡仁治疗创伤性脑水肿的研究进展,以及两者联合应用对颅脑创伤性脑水肿的疗效。

关键词：颅脑创伤十二井穴刺络放血薏苡仁脑水肿

过表达RIPK3对SH-SY5Y细胞CX3CL1基因表达的影响

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武警后勤学院学报（医学版） 2016年第3期25卷 169-173页

作者：张国禄程世翔徐忠伟衣泰龙廖吉连涂悦张赛武警后勤学院附属医院脑科医院天津300162 天津市神经创伤修复重点实验室天津300162 武警部队脑创伤与神经疾病研究所天津300162 武警后勤学院中心实验室天津300309

【目的】建立受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)过表达的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞模型,筛选表达水平受到RIPK3影响的基因,以探讨RIPK3在神经系统中可能具有的生物学效应。【方法】采用分子克... 详细信息

【目的】建立受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)过表达的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y细胞模型,筛选表达水平受到RIPK3影响的基因,以探讨RIPK3在神经系统中可能具有的生物学效应。【方法】采用分子克隆的方式在实验组SH-SY5Y细胞内上调RIPK3的表达水平。激光共聚焦显微镜下观察GFP蛋白的表达情况确认转染结果;以Western blotting确认RIPK3表达变化。通过MTT实验中细胞增值活性的改变确认外源性RIPK3在细胞内是否具有生物学活性。通过转录组测序技术(RNAseq)从m RNA水平对对照组和实验组基因表达水平的变化进行检测,通过生物医学分析研发软件暨资料库(ingenuity pathway analysis,IPA)对RNAseq数据进行分析,获得重要的下游效应分子及相关信号通路,并对其相关作用分子表达发生的改变进行统计。采用Western blotting对部分实验数据进行验证。【结果】RIPK3表达水平上调后,实验组SH-SY5Y细胞增殖活性受到抑制,IPA分析结果显示:CX3CL1的表达水平出现明显上调;与其相关的部分信号分子也发生了相应的改变。其后Western blotting结果从蛋白水平验证了CX3CL1表达水平的变化。【结论】RIPK3能够在m RNA及蛋白水平上调节CX3CL1表达,并对其相关分子产生影响,进而在神经系统各种生理与病理条件下发挥重要的作用。

关键词：受体相互作用蛋白激酶-3 CX3CL1基因神经母细胞瘤

NeuroD1基因过表达对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

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武警后勤学院学报（医学版） 2016年第7期25卷 505-508,F0002页

作者：张仁坤李晓红陈星王景景涂悦张赛武警后勤学院附属医院脑科医院天津市神经创伤修复重点实验室天津300162

【目的】神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞,可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。NSCs分化受多种转录因子调控网络的影响,本实验旨在研究神经分化因子1(neuronal differentiation1,Neu... 详细信息

【目的】神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一群能自我更新并具有多种分化潜能的细胞,可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。NSCs分化受多种转录因子调控网络的影响,本实验旨在研究神经分化因子1(neuronal differentiation1,Neuro D1)过表达对NSCs增殖和分化的影响。【方法】分离培养原代大鼠NSCs,免疫荧光染色鉴定NSCs。将携带Neuro D1基因的逆转录病毒转染NSCs,QPCR检测Neuro D1过表达神经干细胞系的构建。QPCR和MTT检测过表达Neuro D1对NSCs增殖和分化的影响;光镜下观察分化细胞形态变化。【结果】第3代NSCs经免疫荧光染色证实所培养细胞为NSCs,可分化为神经元和星形胶质细胞。QPCR结果显示Neuro D1 m RNA在NSCs-Neuro D1组表达最高,与其他两组有统计学差异(P神经元细胞。【结论】成功构建Neuro D1过表达神经干细胞系。Neuro D1可促进NSCs增殖和向神经元方向分化。

关键词：神经干细胞神经分化因子1 分化

沐舒坦联合异丙托溴铵雾化吸入治疗重型颅脑创伤后肺部感染的效果研究

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中国急救复苏与灾害医学杂志 2015年第5期10卷 447-449,452页

作者：刁云锋程世翔涂悦张赛武警后勤学院附属医院脑科医院/武警部队脑创伤与神经疾病研究所天津市神经创伤修复重点实验室天津300162 天津中医药大学

目的研究沐舒坦联合异丙托溴铵雾化吸入治疗重型颅脑创伤后肺部感染的效果。方法将81例重型颅脑创伤后肺部感染患者按随机原则分为对照组（40例）和沐舒坦联合异丙托溴铵组（41例）。在常规治疗基础上，对照组给予沐舒坦雾化吸入治疗，... 详细信息

目的研究沐舒坦联合异丙托溴铵雾化吸入治疗重型颅脑创伤后肺部感染的效果。方法将81例重型颅脑创伤后肺部感染患者按随机原则分为对照组（40例）和沐舒坦联合异丙托溴铵组（41例）。在常规治疗基础上，对照组给予沐舒坦雾化吸入治疗，沐舒坦联合异丙托溴钱组给予沐舒坦联合异丙托溴铵雾化吸入治疗。观察并比较两组患者治疗前及治疗10天后体温、白细胞计数、动脉血氧分压、动脉血气分析氧合指数变化；比较两组患者治疗10d时的感染控制率以及感染控制平均时间。结果两组患者治疗10d后与本组治疗前相比，体温均明显下降，白细胞计数均明显降低、动脉血氧分压和动脉血气分析氧合指数均明显升高，差异具有统计学意义（均P〈0．01）；沐舒坦联合异丙托溴铵组患者治疗10d后与对照组治疗10d后相比，体温下降更快（36．86±0．72比37．32±0．81），白细胞计数更低（7．63±2．34比9．08±2．52），动脉血氧分压更高（90．74±9．07比84．88±8．65），动脉血气分析氧合指数更高（308．62±31．67比281．19±33．06），差异均有统计学意义。沐舒坦联合异丙托溴铵组治疗10d时的感染控制率明显高于对照组（82．9％比62．5％）；沐舒坦联合异丙托溴铵组的感染控制平均时间明显短于对照组（6．3±2．4比12．8±4．5）。结论沐舒坦联合异丙托溴铵雾化吸入对于患者重型颅脑创伤后肺部感染的治疗效果明显优于单独使用沐舒坦治疗，有临床推广价值。

关键词：沐舒坦异丙托溴铵雾化吸入重型颅脑创伤肺部感染

哇巴因调控Akt/mTOR信号通路诱导U87-MG细胞死亡的机制研究

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中国医药导报 2017年第3期14卷 4-7页

作者：杨小飒李培炎李杰衣泰龙徐忠伟涂悦程世翔武警后勤学院附属医院脑科医院武警部队脑创伤与神经疾病研究所天津市神经创伤修复重点实验室天津300162 武警后勤学院二旅九营天津300309 武警后勤学院中心实验室天津300309

目的探讨哇巴因(ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞死亡的影响及具体机制。方法将培养的U87-MG细胞随机分为正常对照(Control)组和ouabain组,分别加入常规培养基和不同浓度ouabain(0.05、0.5、2.5、25μmol/L)干预24 h,光学显微镜观察ouabai... 详细信息

目的探讨哇巴因(ouabain)对人胶质瘤U87-MG细胞死亡的影响及具体机制。方法将培养的U87-MG细胞随机分为正常对照(Control)组和ouabain组,分别加入常规培养基和不同浓度ouabain(0.05、0.5、2.5、25μmol/L)干预24 h,光学显微镜观察ouabain干预后24 h细胞的形态改变,MTT实验检测细胞活力,免疫印迹法(Western blot)检测Akt、p-Akt、m TOR和p-m TOR的表达变化。结果与Control组比较,ouabain显著降低U87-MG细胞活力(均P<0.01),且呈现浓度依赖性;高浓度ouabain(2.5、25μmol/L)与Control组相比能够降低U87-MG细胞中p-Akt、m TOR和p-m TOR的表达(均P<0.01)。结论高浓度ouabain可能通过抑制胞内Akt/m TOR信号通路,降低肿瘤细胞活力并最终引起细胞死亡。

关键词：哇巴因胶质瘤人胶质瘤U87-MG细胞 Akt/mTOR信号通路

亚低温联合载神经干细胞的纤维蛋白支架对颅脑创伤的修复作用

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天津医药 2016年第2期44卷 181-184,I0001页

作者：廖余平陈翀李晓红王景景陈以胜张赛孙洪涛脑创伤与神经疾病研究所武警后勤学院附属医院脑科医院天津市神经创伤修复重点实验室300162 辽宁医学院武警后勤学院附属医院研究生培养基地

目的研究大鼠颅脑创伤(TBI)后原位移植神经干细胞(NSCs)治疗的可能性,探讨载有NSCs的纤维蛋白支架及与亚低温(MHT)联合对TBI的治疗作用。方法从孕14 d SD大鼠皮质组织中分离NSCs,与纤维蛋白支架共培养,应用扫描电镜观察支架及NSCs的形态... 详细信息

目的研究大鼠颅脑创伤(TBI)后原位移植神经干细胞(NSCs)治疗的可能性,探讨载有NSCs的纤维蛋白支架及与亚低温(MHT)联合对TBI的治疗作用。方法从孕14 d SD大鼠皮质组织中分离NSCs,与纤维蛋白支架共培养,应用扫描电镜观察支架及NSCs的形态,并通过免疫荧光检测细胞类型。将48只雄性SD大鼠随机分成TBI组(A组)、TBI+NSC组(B组)、TBI+MHT组(C组)、TBI+NSC+MHT组(D组),每组12只。A组通过液压损伤仪行TBI造模;B组TBI后接受NSCs移植治疗;C组TBI后接受MHT治疗;D组TBI后接受NSCs与MHT联合治疗。分别在第14、28天通过神经功能缺陷评分(m NSS)和水迷宫实验对大鼠进行神经功能评价;28 d后取脑组织切片,行细胞免疫荧光检测,观察移植后的NSCs在体内分化情况。结果电镜扫描显示,NSCs与纤维蛋白支架共培养3 d后形态无明显改变;免疫荧光提示NSCs特异性标志物Nestin阳性表达,表明神经干细胞在纤维蛋白支架上存活;D组大鼠的m NSS在第14天和第28天均低于A、B、C各组;水迷宫结果显示,D组大鼠逃避潜伏期短于A、B、C各组;D组28 d后脑组织取材可追踪到Brd U标记的神经干细胞分化为了神经元。结论纤维蛋白支架与NSCs生物相容性良好,具有可降解性。亚低温与载NSCs的纤维蛋白支架对大鼠TBI后的神经功能修复具有协同作用。

关键词：颅脑损伤神经干细胞纤维蛋白支架亚低温

亚低温治疗对颅脑创伤后β-淀粉样蛋白表达影响的实验研究

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中华神经外科杂志 2012年第2期28卷 166-169页

作者：涂悦程世翔孙洪涛张赛天津中医药大学武警部队脑创伤与神经疾病研究所、武警医学院附属医院脑系科中心天津300162

目的探讨亚低温治疗对大鼠颅脑创伤（TBI）后β-淀粉样蛋白（Ap）基因和蛋白表达的影响。方法将60只SD大鼠分为假手术组（n=20）、常温脑创伤组（37℃，n=20）和亚低温脑创伤组（32℃，n=20）。建立SD大鼠液压打击致颅脑创伤模型。亚低... 详细信息

目的探讨亚低温治疗对大鼠颅脑创伤（TBI）后β-淀粉样蛋白（Ap）基因和蛋白表达的影响。方法将60只SD大鼠分为假手术组（n=20）、常温脑创伤组（37℃，n=20）和亚低温脑创伤组（32℃，n=20）。建立SD大鼠液压打击致颅脑创伤模型。亚低温脑创伤组在液压打击伤后立即接受持续6h的亚低温治疗。伤后24h处死大鼠并取海马组织行HE染色，用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western blot）和免疫组化法检测Aβ基因转录和蛋白的表达。结果与假手术组比较，颅脑创伤后24hAβ免疫阳性细胞数明显增加（P＜0．01），其mRNA和蛋白表达分别升高1．58和1．76倍。与常温脑创伤组比较，亚低温组Aβ免疫阳性细胞数明显减少（P＜0．01），其mRNA和蛋白表达分别下降68％和64％。结论亚低温治疗可降低颅脑创伤后AB基因转录和蛋白的上调表达，通过抑制Ap的神经毒性来发挥神经保护作用，而亚低温与Aβ的确切关系还有待进一步研究。

关键词：外伤性脑损伤 β-淀粉样蛋白亚低温

β-七叶皂苷钠对颅脑创伤大鼠脑水肿的保护作用

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天津医药 2017年第9期45卷 920-924页

作者：刘宝虎郭彤彤江继鹏陈旭义边科砜张赛天津中医药大学 300193 武警后勤学院附属医院脑科中心武警部队脑创伤与神经疾病研究所天津市神经创伤修复重点实验室武警后勤学院学员二旅

目的探讨β-七叶皂苷钠对颅脑创伤(TBI)大鼠脑水肿的保护作用。方法筛选成年雄性SD大鼠78只,按随机数字表法分为假手术(Sham)组、颅脑创伤(TBI)组、β-七叶皂苷钠组,每组26只。Sham组仅开骨窗不做处理;TBI组和β-七叶皂苷钠组开骨窗后... 详细信息

目的探讨β-七叶皂苷钠对颅脑创伤(TBI)大鼠脑水肿的保护作用。方法筛选成年雄性SD大鼠78只,按随机数字表法分为假手术(Sham)组、颅脑创伤(TBI)组、β-七叶皂苷钠组,每组26只。Sham组仅开骨窗不做处理;TBI组和β-七叶皂苷钠组开骨窗后采用电子脑皮质损伤撞击仪(e CCI)建立大鼠TBI模型,其中TBI组只建模但不干预,β-七叶皂苷钠组建立模型后即刻给予腹腔注射β-七叶皂苷钠(5 mg/kg),每24 h重复给药1次。损伤后48 h采用改良神经功能缺损评分(mNSS)观察TBI神经功能改变,伤后48 h处死大鼠并取脑组织行HE染色(n=6);采用干/湿比重法测定脑组织含水量变化(n=10);采用伊文思蓝染色(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性(n=4);采用免疫印迹(Western-blot)法检测水通道蛋白4(AQP4,n=6)的表达水平。结果与Sham组比较,TBI大鼠神经功能受损,脑组织含水量增加,BBB被破坏,AQP4蛋白表达升高;而β-七叶皂苷钠可改善TBI大鼠的神经功能受损程度,降低脑组织含水量,改善BBB通透性,并显著降低AQP4表达水平(均P脑保护作用,可显著改善大鼠受损的神经功能,降低伤后脑水肿,改善BBB通透性,其机制可能与下调AQP4的表达有关。

关键词：七叶素颅脑损伤脑损伤水通道蛋白质4 脑水肿 β-七叶皂苷钠 aquaporin 4