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mRNA疫苗生产工艺及质量控制的研究进展

中国新药杂志 2024年第11期33卷 1109-1114页

作者：唐琪施金荣邢沛东聂希霖杨晓明武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室武汉430207 武汉生物制品研究所有限责任公司质量控制室武汉430207 武汉生物制品研究所有限责任公司质量保证部武汉430207 中国生物技术股份有限公司北京100029

由于mRNA疫苗具有结构简单、构建快速及保护效果好等特点,在应对病原体变异及新发传染病方面表现出了明显优势,作为疫苗研发的新一代技术引起了各方的广泛关注,但是其在生产工艺和质量控制方面还缺乏系统的研究和报道。本综述对mRNA疫... 详细信息

由于mRNA疫苗具有结构简单、构建快速及保护效果好等特点,在应对病原体变异及新发传染病方面表现出了明显优势,作为疫苗研发的新一代技术引起了各方的广泛关注,但是其在生产工艺和质量控制方面还缺乏系统的研究和报道。本综述对mRNA疫苗制备工艺的主要流程、工艺特征进行了阐述,根据各国指南文件及相关研究,对其制备工艺中起始材料、原液、中间制剂及成品的关键质量控制要素进行梳理,并对其检测方法进行总结归纳,为mRNA疫苗的研发与制备提供参考。

关键词： mRNA疫苗生产工艺质量控制检测方法

T细胞依赖的双特异性抗体结构设计的研究进展

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细胞与分子免疫学杂志 2024年

作者：李清泓梁红远上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室

随着抗体工程的不断发展，靶向CD3的T细胞依赖的双特异性抗体已经发展出多种多样的结构，从而满足更多临床治疗的需求。依据是否含有Fc段可将T细胞依赖的双特异性抗体分为IgG样和非IgG样两种结构。其中轻重链错配问题是双特异性抗体最... 详细信息

随着抗体工程的不断发展，靶向CD3的T细胞依赖的双特异性抗体已经发展出多种多样的结构，从而满足更多临床治疗的需求。依据是否含有Fc段可将T细胞依赖的双特异性抗体分为IgG样和非IgG样两种结构。其中轻重链错配问题是双特异性抗体最常见的制备难点，为解决该问题，目前已有多种技术应用于其结构设计中，包括杵臼技术、结构域交换技术等。由于T细胞依赖的双特异性抗体的作用机制是将T细胞重定向至肿瘤细胞继而发挥杀伤作用，因此Fc段杀伤功能的沉默、靶点的亲和力设计，以及免疫突触形成的距离设计均是T细胞依赖的双特异性抗体结构设计的重点。本文将围绕以上针对T细胞依赖的双特异性抗体结构设计的研究进展进行总结。

关键词：双特异性抗体 T细胞接合器抗体结构蛋白质工程综述

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纳米抗体偶联药物的研究进展

药学学报 2024年第5期59卷 1210-1217页

作者：张雪嫣周柏松刘玉林长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130012

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)因其具有靶点清晰、特异性强等优点已成为临床上治疗多种疾病尤其是癌症的有效手段。但传统ADC中的单克隆抗体组织渗透能力差,存在免疫原性和免疫毒性等风险,且改造成本高。由驼科动物血液中... 详细信息

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)因其具有靶点清晰、特异性强等优点已成为临床上治疗多种疾病尤其是癌症的有效手段。但传统ADC中的单克隆抗体组织渗透能力差,存在免疫原性和免疫毒性等风险,且改造成本高。由驼科动物血液中提取的纳米抗体(nanobody,Nb)是目前已知具有完整抗原结合能力的最小抗体片段,具有组织渗透能力强、免疫原性低、特异性强、稳定性高等优势,可以代替传统单克隆抗体参与构建纳米抗体偶联药物(nanobody-drug conjugate,NDC)。本文从纳米抗体结构优势、NDC的构建、纳米抗体偶联物的应用三个方面进行综述与讨论,以期为NDC的研究与发展提供思路。

关键词：纳米抗体抗体偶联药物纳米抗体偶联药物

抗猴痘病毒A35R蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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微生物学免疫学进展 2024年

作者：欧阳蕾吴佩璇师江龙潘勇兵武汉生物制品研究所有限责任公司抗体研究室

目的制备抗猴痘病毒（monkeypox virus， MPXV）A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法，同时对方法进行验证。方法原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体，对单克隆抗体的特异... 详细信息

目的制备抗猴痘病毒（monkeypox virus， MPXV）A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法，同时对方法进行验证。方法原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体，对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定；建立双抗体夹心ELISA检测方法，对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证。结果制备了7株抗MPXV A35R单克隆抗体。Western blot鉴定结果显示，7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应；7株单克隆抗体结合活性为11.35～27.73 ng/mL；抗体经配对筛选后，确定以7G5和2F5为最佳配对抗体，用于建立双抗体夹心ELISA方法。该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×104TCID50/mL，对MPXV A35R蛋白最低检测限为1.95 ng/mL，线性范围为3.91～125.00 ng/mL，线性回归方程为y=1.732 0x-0.920 8，R2=0.984 3；该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应；准确性验证结果显示，病毒抗原回收率为96.94%～110.04%；批间CV为0.26%～8.13%，批内CV为2.10%～5.48%。结论成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测方法。验证结果显示，该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性，可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制。

关键词：猴痘病毒 A35R蛋白单克隆抗体双抗体夹心ELISA 抗原检测蛋白质亚单位疫苗质量控制

新型冠状病毒S1、S2和NTD抗原特异性B细胞及其亚型标记技术的建立与应用

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病毒学报 2024年第4期 679-686页

作者：宋彦丽杨惠洁赵玉秀鲍春婷李淑艳李长贵武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室北京生物制品研究所课题一组长春生物制品研究所有限责任公司疫苗研究室

建立一种新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）S1、S2、NTD蛋白特异性B细胞及其亚型的标记技术，该技术可通过与流式细胞术联用检测抗原特异性B细胞及其亚型含量，或与10×免疫组库联用对抗原... 详细信息

建立一种新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）S1、S2、NTD蛋白特异性B细胞及其亚型的标记技术，该技术可通过与流式细胞术联用检测抗原特异性B细胞及其亚型含量，或与10×免疫组库联用对抗原特异性B细胞进行测序。首先，测试最佳蛋白使用浓度：将生物素标记的S1、S2和NTD蛋白按照600 nmol/L、1 200 nmol/L、2 400 nmol/L、3 600 nmol/L和4 800 nmol/L分别与荧光素-亲和素偶联，通过流式检测S1+CD19+B、S2+CD19+B、NTD+CD19+B细胞占比，确定不同蛋白对应的最佳使用浓度；进一步优化生物素-蛋白与荧光素-亲和素的比例：将检测生物素-蛋白与荧光-亲和素的摩尔比分别按照4∶1,5∶1和6∶1比例测试，对小鼠脾脏S1+CD19+B、S2+CD19+B、NTD+CD19+B细胞及S1+CD19+CD27+B、S2+CD19+CD27+B、NTD+CD19+CD27+B细胞的检测效果，优化荧光素-亲和素的最佳使用量；通过测试BV421、Super Bright 600、PE、PE/Cy7和APC等荧光对小鼠脾细胞的非特异结合能力，选择非特异结合较弱的荧光；根据筛选的荧光，给生物素化的S1、S2和NTD均标记PE和APC荧光，建立检测这3个蛋白特异性B细胞和记忆B细胞的方法，并测试带核酸序列的荧光素-亲和素对B细胞和记忆B细胞的检测效果，测试该方法的稳定性。S1、S2和NTD蛋白浓度分别为4 800 nmol/L、3 600 nmol/L和3 600 nmol/L时，对B细胞的检测效果最佳，且对阴性小鼠的染色效果较低；生物素-S1蛋白与荧光素-亲和素的最佳摩尔比为6∶1时，检测结果最佳；生物素-S2蛋白、生物素-NTD蛋白与荧光素-亲和素均在4:1时，检测结果最佳，且在该浓度下BV421、APC、Super Bright 600、PE与细胞的非特异结合较弱；建立了一种检测SARS-CoV-2 S1、S2和NTD抗原特异性B细胞及记忆B细胞的方法，通过对一批样本的重复3次检测，发现该方法较为稳定，CV值≤20%。通过抗原特异性B细胞标记技术，实现了对SARS-CoV-2S1、S2和NTD蛋白特异性B细胞及其亚型标记技术方法，并且具有良好的适用性，可用于与流式细胞术检测抗原特异性B细胞及记忆B细胞和10×免疫组库测序联合使用。

关键词：流式细胞术生物素-蛋白荧光素-亲和素新型冠状病毒抗原特异性B细胞

WHO对我国疫苗生产企业现场检查中变更控制缺陷分析

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中国医药工业杂志 2024年第5期55卷 725-730页

作者：张磊高易娥王凌武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207

文章通过查阅WHO网站公开的检查信息及中国生物共享共治交流的检查信息,整理、汇总了变更管理中的相关缺陷比例、严重程度及来源,分析WHO对我国疫苗生产企业现场检查变更管理相关缺陷及缺陷产生的原因,针对已识别的问题提出应对策略。... 详细信息

文章通过查阅WHO网站公开的检查信息及中国生物共享共治交流的检查信息,整理、汇总了变更管理中的相关缺陷比例、严重程度及来源,分析WHO对我国疫苗生产企业现场检查变更管理相关缺陷及缺陷产生的原因,针对已识别的问题提出应对策略。期望为我国药品生产企业申请WHO药品预认证和紧急使用、完善变更控制体系提供借鉴。

关键词： WHO 现场检查变更控制

利用实验设计筛选并优化SARS-CoV-2单抗F61亲和层析阶段工艺参数

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 731-738页

作者：孙文泽陈莹詹珊珊邓小杰黄嘉欣王炯宋刚刘建邦桂芳潘勇兵武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430074

目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择... 详细信息

目的利用实验设计(Design of Experiment,DoE)筛选及优化实验对SARS-CoV-2单抗F61亲和层析工艺参数进行筛选及优化,获得最佳工艺条件。方法选择8个可能在亲和层析中影响实验响应结果的工艺参数并制定其水平范围,利用DoE筛选实验对选择的工艺参数进行8因子2水平筛选实验,通过检测响应值,用统计学软件拟合数学模型,经帕累托图分析获得3个显著影响关键质量属性的关键工艺参数(P<0.05),再选择DoE响应曲面法对关键工艺参数进行优化实验。首先完成全析因实验设计部分,检测响应结果拟合数学模型,分析弯曲项P值判断显著因子的工艺参数范围处于最佳范围内(弯曲P<0.05)后,再根据实验的序贯性补齐中心复合表面设计(central composite face-centered design,CCF)实验,通过检测响应结果拟合响应曲面模型,获得工艺最佳条件范围,最终通过重复试验验证最佳参数值的稳定性。结果在筛选实验中获得在亲和层析阶段影响F61的显著因子为洗脱缓冲液pH、洗脱缓冲液盐浓度、中间淋洗缓冲液盐浓度、平衡缓冲液盐浓度。通过CCF实验最终获得亲和层析中关键工艺参数的最佳条件,当洗脱缓冲液pH为3.2、洗脱缓冲液盐浓度为0.07 mol/L NaCl、中间淋洗缓冲液盐浓度为0.31 mol/L NaCl,F61在亲和层析阶段收率达95.25%,宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量为97.33 ppm,样品单体纯度达98.51%。结论用不同类型DoE方法进行了F61亲和层析阶段工艺参数的筛选和优化,获得了最佳工艺条件,为F61纯化工艺的建立奠定了基础。

关键词：实验设计亲和层析 SARS-CoV-2单抗筛选实验优化实验中心复合表面设计

生物反应器微载体Vero细胞罐外消化放大培养对狂犬病病毒CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响

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中国生物制品学杂志 2024年第5期37卷 532-536页

作者：杨敏宋远涛王玲徐晓文聪陈杰杉王月莉梁婧武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207

目的探讨微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器对狂犬病病毒(rabies virus,RABV)CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响。方法将第140代Vero细胞于37℃培养72~120 h后,按1∶4的细胞密度比传代扩增至10层细胞工厂,... 详细信息

目的探讨微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器对狂犬病病毒(rabies virus,RABV)CTN-1Ⅴ株产毒能力的影响。方法将第140代Vero细胞于37℃培养72~120 h后,按1∶4的细胞密度比传代扩增至10层细胞工厂,继续培养72~120 h;将单层致密细胞消化后接种至30 L生物反应器,微载体7~10 g/L,培养温度37℃,pH(7.0~7.4),溶氧30%~80%,搅拌速度10~50 r/min,连续灌流培养72~120 h,共培养3批;微载体Vero细胞经罐外细胞消化后放大培养至300 L生物反应器,微载体5~8 g/L,培养温度37℃,pH(7.0~7.4),溶氧30%~80%,搅拌速度30~80 r/min,灌流培养72~120 h;按MOI=0.05接种RABV CTN-1Ⅴ株,每24 h收获病毒液1次,检测病毒滴度和抗原含量。结果30 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为1×10^(7)个/mL;300 L生物反应器微载体Vero细胞培养96 h后密度约为7.4×10^(6)个/mL。病毒接种96 h达峰值,病毒平均滴度为6.8 lgLD50/mL,抗原平均含量为2.58 IU/mL。结论微载体Vero细胞从30 L生物反应器经罐外细胞消化放大培养至300 L生物反应器的工艺稳定可行,对RABV CTN-1Ⅴ株的产毒能力影响较小,可为RABV灭活疫苗大规模生产提供参考资料。

关键词：狂犬病病毒 Vero细胞生物反应器微载体罐外消化放大培养

重组腺病毒5型-诺如病毒GⅡ.4型-VP1病毒样颗粒的表达及鉴定

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中国生物制品学杂志 2024年第2期37卷 138-142页

作者：汪梦俊孙楠裴捷刘睿伦邹文琪熊宇王文辉于代冠申硕武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室湖北武汉430207

目的采用293T细胞表达重组腺病毒5型(recombinant adenovirus 5,rAd5)-诺如病毒(Norovirus,NoV)GⅡ.4型-VP1病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),并进行鉴定。方法将重组腺病毒质粒pAd5-eGFP及pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1分别转染293T细胞,拯救获得重组腺病毒rAd5-eGFP和rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1。rAd5-eGFP在293T细胞上连续传代,验证其载体功能。将rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1在293T细胞上进行传代,NoV-GⅡ.4-VP1经表达及纯化后,自组装形成NoV-GⅡ.4-VLP,并进行Western blot、ELISA检测及电镜观察。结果镜下观察各代rAd5-eGFP均可见绿色荧光,且亮度随代次增加而增强。各代rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1收获液中均可见NoV-GⅡ.4-VP1蛋白表达,相对分子质量约58 900。NoV-GⅡ.4-VLP可与兔抗NoV-GⅡ.4-VP1血清发生特异性结合,具有与天然的NoV病毒颗粒相似构象,可有效识别志愿者唾液样本中的NoV受体;镜下观察,其形态完整,呈球状,直径为43.5~58.3 nm,颗粒表面有少数突起,可能为VP1自组装时暴露于颗粒表面的P结构域。结论表达的重组腺病毒NoV-GⅡ.4-VLP具有完整的VLP结构和良好的特异性,有望用于NoV腺病毒载体疫苗的相关研究。

关键词：腺病毒诺如病毒 VP1 病毒样颗粒腺病毒载体疫苗