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一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2013年第7期35卷 521-525页

作者：白昀冯志新甘源刘占军张旭韦艳娜马庆红邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京天邦生物科技有限公司江苏南京211102

为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(SIV)。对分离株进行血... 详细信息

为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(SIV)。对分离株进行血凝试验、EID50测定、HA及NA基因测序分析和感染小鼠及猪体试验。结果有18份样品RT-PCR显示为SIV阳性,但只有一株可在SPF鸡胚中稳定增殖。该病毒分离株具有凝集0.5%鸡红细胞的活性,EID50为10-6.32/0.1 mL,基因测序显示其HA、NA基因片段均与09年H1N1型流感流行株A/California/04/2009(H1N1)高度同源,将其命名为A/Swine/Nanjing/50/2011(H1N1)。小鼠人工感染试验表明该分离株可引起小鼠死亡(3/10),猪体人工感染实验显示该分离株还能够引发猪体明显的流感症状及肺部病变。该病毒的分离鉴定及HA、NA基因序列分析为进一步调查SIV的流行规律提供了基础数据。

关键词：猪流感病毒 H1N1亚型分离鉴定 HA基因 NA基因

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猪肺炎支原体显色原位杂交研究方法的建立

中国预防兽医学报 2012年第3期34卷 214-218页

作者：王占伟熊褀琰刘茂军冯志新白方方邵国青江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京天邦生物科技有限公司江苏南京210012

为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法,本研究利用地高辛标记的Mhp P36核酸探针和DAB/H2O2显色系统,对人工Mhp感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺组织样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示,设计的地... 详细信息

为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法,本研究利用地高辛标记的Mhp P36核酸探针和DAB/H2O2显色系统,对人工Mhp感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺组织样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示,设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性,而与其他的猪病原菌无交叉反应;检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管/细支气管黏膜表面。人工感染组、自然感染组和健康对照组的CISH结果与PCR检测结果一致,临床样品的CISH检测结果低于PCR检测结果。本研究建立的Mhp显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法,可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究。

关键词：猪肺炎支原体显色原位杂交斑点杂交检测定位

猪弓形虫重组MIC3蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

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畜牧兽医学报 2013年第10期44卷 1622-1628页

作者：白昀王海燕王占伟纪燕吴叙苏刘冬霞邵国青江苏省农业科学院兽医研究所.农业部兽用生物制品工程技术重点实验室.国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京天邦生物科技有限公司南京211102 南京农业大学南京210095

为获得针对猪弓形虫MIC3蛋白的单克隆抗体,为进一步研制免疫金标试纸条提供材料,作者以纯化的重组MIC3蛋白免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)。经ELISA筛选阳性克隆和亚克隆建株,体内诱生腹水法制备McAb,测定其亚类、... 详细信息

为获得针对猪弓形虫MIC3蛋白的单克隆抗体,为进一步研制免疫金标试纸条提供材料,作者以纯化的重组MIC3蛋白免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)。经ELISA筛选阳性克隆和亚克隆建株,体内诱生腹水法制备McAb,测定其亚类、效价,进行Western blot分析,并利用胶体金颗粒标记的McAb制备免疫金标试纸条。成功制备了2株稳定分泌抗MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株B7和D3,2株McAb的免疫球蛋白亚类均为IgG2a,其ELISA腹水效价分别为1∶64万和1∶192万,Western blot结果表明,2株McAbs腹水均能分别与纯化的重组MIC3蛋白和猪弓形虫全虫蛋白中大小为56和38ku左右的蛋白发生特异性反应;用纯化后McAb标记的胶体金颗粒制备的免疫金标试纸条可以检测到最低浓度为4×104 CFU·mL-1的弓形虫速殖子。本研究为猪弓形虫病的现场诊断提供了有效的方法,显示出很好的临床应用前景。

关键词：岗地弓形虫 MIC3蛋白单克隆抗体胶体金

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猪O型口蹄疫病毒样颗粒的构建及鉴定

中国畜牧兽医 2019年第11期46卷 3350-3357页

作者：刘汉平上海海利生物技术股份有限公司上海兽用生物制品工程技术研究中心

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP 1、VP 2、VP 3和VP 44个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模... 详细信息

为开发猪O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLPs)基因工程亚单位疫苗,试验参考GenBank中登录的FMDV毒株基因序列(登录号:JN998085),设计针对VP 1、VP 2、VP 3和VP 44个基因片段的特异性引物,以O型FMDV O/MYA98/XJ/2010毒株的cDNA序列为模板,对目的基因进行PCR扩增;将获得的VP 3、VP 1和VP 4、VP 2基因片段分别插入2个杆状病毒供体质粒(pFastBacDual)的p10和pH双元启动子中,构建pFBD-VP3-VP1和pFBD-VP4-VP22个重组转座质粒;将验证正确的2个重组转座质粒分别转化含有穿梭载体(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得2个重组杆粒rBacmid-VP3-VP1和rBacmid-VP4-VP2,经验证正确后,对其进行扩增和提取,将其分别转染Sf9贴壁昆虫细胞,构建2个重组杆状病毒rvAc-VP3-VP1和rvAc-VP4-VP2;2个重组杆状病毒共同感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞,利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞内对4个基因进行表达,目的蛋白通过间接免疫荧光试验(IFA)、SDS-PAGE、Western blotting及透射电镜(EM)进行检测。结果显示,本研究成功构建2株分别表达FMDV VP1、VP2、VP3和VP44个结构蛋白的重组杆状病毒;特异性抗体检测发现,4个蛋白VP1~VP4均成功表达,且具有良好的特异性反应;4个蛋白在Sf9昆虫细胞内能够完成自我组装,形成与天然病毒结构相似的VLPs,直径大小在25~30 nm。本研究利用共感染表达方式在Sf9昆虫细胞内成功制备出FMDV病毒颗粒,为开发高效安全的FMDV基因工程亚单位疫苗开辟了一条新思路。

关键词：口蹄疫病毒(FMDV) 结构蛋白重组杆状病毒病毒样颗粒(VLPs)

鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联活疫苗的研究

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中国兽药杂志 2002年第9期36卷 22-24页

作者：李大山方红梅吴金刘洪斌郭兴福杭州荐量生物制品有限公司浙江杭州310011 黑龙江省生物制品一厂黑龙江哈尔滨150069

鸡新城疫(ND)La Sota、传染性支气管炎(IB)H120和传染性法氏囊病(IBD)B87弱毒株适当稀释后等量混合,经10日龄SPF鸡胚同胚接种联合培养,收获含毒鸡胚液和胎儿混合制成ND、IB、IBD三联活疫苗.接种7～14日龄SPF雏鸡7 d产生抗体,14～21d达... 详细信息

鸡新城疫(ND)La Sota、传染性支气管炎(IB)H120和传染性法氏囊病(IBD)B87弱毒株适当稀释后等量混合,经10日龄SPF鸡胚同胚接种联合培养,收获含毒鸡胚液和胎儿混合制成ND、IB、IBD三联活疫苗.接种7～14日龄SPF雏鸡7 d产生抗体,14～21d达到高峰,免疫期70d以上,与单苗同步免疫并攻击强毒,试验结果无显著性差异.以10个使用剂量免疫SPF雏鸡,无ND、IB、IBD临床症状和剖检病变,其安全性和效力检验均达到相应单苗的标准要求.

关键词：鸡新城疫传染性支气管炎传染性法氏囊病三联活疫苗同胚接种

猪圆环病毒2型Cap基因多拷贝质粒的构建及病毒样颗粒的表达

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动物医学进展 2019年第9期40卷 1-6页

作者：尹曼曼刘汉平楼觉人上海海利生物技术股份有限公司/上海市兽用生物制品工程技术中心上海奉贤201403

通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap的毕赤酵母菌株。将Cap的基因克隆到pPIC3.5K载体中后,利用同尾酶技术将表达盒(5′AOX-Cap-TT)重复插入载体,分别构建了含有1、2、4、6个拷贝基因数的表达质粒并通过电转... 详细信息

通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap的毕赤酵母菌株。将Cap的基因克隆到pPIC3.5K载体中后,利用同尾酶技术将表达盒(5′AOX-Cap-TT)重复插入载体,分别构建了含有1、2、4、6个拷贝基因数的表达质粒并通过电转化导入KM71菌株,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达;绘制不同拷贝数重组菌株的生长曲线;表达产物经纯化后透射电镜观察是否组装形成病毒样颗粒(VLPs)并免疫小鼠评估其免疫原性。Western blot结果显示,Cap蛋白能够在酵母细胞内表达,且6拷贝质粒的重组菌表达量最高;生长曲线显示拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响;电镜下观察到表达的Cap蛋白能够自发装配成直径约为20 nm、与天然PCV2粒子大小相当、均一的VLPs;纯化后的VLPs免疫接种小鼠后能有效刺激机体产生PCV2抗体。含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高重组毕赤酵母中Cap的表达量。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白多拷贝数毕赤酵母病毒样颗粒

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我国规模化猪场对猪伪狂犬病的控制

中国畜牧兽医 2007年第2期34卷 112-115页

作者：邓仕伟薛春芳汪勇四川华神兽用生物制品有限公司成都610023

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病。规模化猪场应根据野毒感染的严重程度采取切合实际的控制策略,疫苗免疫是重要的控制手段。常规灭活苗、常规弱毒苗、基因缺失疫苗都有不同的特点和使用范围,经过分析国内规模化猪场... 详细信息

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病。规模化猪场应根据野毒感染的严重程度采取切合实际的控制策略,疫苗免疫是重要的控制手段。常规灭活苗、常规弱毒苗、基因缺失疫苗都有不同的特点和使用范围,经过分析国内规模化猪场使用基因缺失疫苗是最好的选择。笔者在免疫程序及方式方面对有争议的问题如首免日龄、超前免疫、免疫间隔时间、滴鼻免疫等进行了分析;强调了免疫监测的重要性。提出了规模化猪场净化猪伪狂犬病的措施及可行性,总结了国内某些场成功的经验,为猪场控制该病提供实践参考。

关键词：规模化猪场伪狂犬病控制

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鸡传染性法氏囊病病毒抗血清的研制

南方农业学报 2012年第12期43卷 2079-2082页

作者：王占伟邵国青刘茂军冯志新王丽高云飞周开华尹秀凤江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 南京天邦生物科技有限公司南京210012

【目的】确保鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗血清高效力的同时又彻底解决安全性和免疫应激问题,旨在研制出一种高效、安全的鸡传染性法氏囊病(IBD)预防和治疗制品。【方法】以SPF鸡为免疫动物,按照《兽用生物制品试验研究指导技术原则》... 详细信息

【目的】确保鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗血清高效力的同时又彻底解决安全性和免疫应激问题,旨在研制出一种高效、安全的鸡传染性法氏囊病(IBD)预防和治疗制品。【方法】以SPF鸡为免疫动物,按照《兽用生物制品试验研究指导技术原则》和《中华人民共和国兽药典》(2010年版)的要求研制IBDV抗血清,经脱毒处理后,对其半成品及成品进行检验。【结果】以IBDVNJ株免疫4周龄SPF鸡获得的抗血清,未脱毒处理前的血清效价≥1∶64,脱毒处理后的成品效价≥1∶32。半成品和成品的检验结果显示,经过脱毒处理后的IBDV抗血清制品呈橙黄色,无菌、无支原体、无外源病毒,对小白鼠、豚鼠和SPF鸡均安全,甲醛和硫柳汞残留量也未超过规定标准。【结论】研制的IBDV抗血清制品符合《中华人民共和国兽药典》的要求,完全可用于IBD的紧急预防和早期治疗,今后可作为一个正规产品上市以满足市场需要。

关键词：鸡传染性法氏囊病抗血清治疗 SPF鸡脱毒处理

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我国非洲猪瘟病毒检测技术专利分析

病毒学报 2023年第1期39卷 222-230页

作者：李静张蕾董春娜李鹏宇齐鹏肖进中牧实业股份有限公司农业部兽用生物制品与化药重点实验室北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心北京100095

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的烈性传染病。2018年8月我国首次暴发ASF疫情,由于没有有效的商品化疫苗,导致疫情蔓延至我国各省份。随着疫情的发展,准确、快速的诊断技... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的烈性传染病。2018年8月我国首次暴发ASF疫情,由于没有有效的商品化疫苗,导致疫情蔓延至我国各省份。随着疫情的发展,准确、快速的诊断技术成为疫情防控的关键。本文梳理总结了我国ASFV诊断检测技术专利现状,包括ELISA、免疫层析技术等免疫学检测方法和PCR、等温扩增技术、基于CRISPR/Cas系统开发的多种分子生物学检测方法,以期为我国ASF疫病防控及诊断产品的研发提供有价值的参考。

关键词：非洲猪瘟诊断检测专利分析

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