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基于网络药理学及验证实验探讨淡豆豉治疗流感的作用机制

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中药药理与临床 2022年第6期38卷 102-109页

作者：路鑫怡何泳愉杨灿郭潮潭杭州医学院检验医学院与生物工程学院杭州310013

目的:淡豆豉广泛应用于治疗流感的方剂中,本研究结合网络药理学和细胞实验初步探讨淡豆豉抗流感病毒作用方式、物质基础和分子生物学基础。方法:通过TCMSP和TCM-ID数据库获取淡豆豉中的活性成分,借助PharmMapper数据库和Swiss target pr... 详细信息

目的:淡豆豉广泛应用于治疗流感的方剂中,本研究结合网络药理学和细胞实验初步探讨淡豆豉抗流感病毒作用方式、物质基础和分子生物学基础。方法:通过TCMSP和TCM-ID数据库获取淡豆豉中的活性成分,借助PharmMapper数据库和Swiss target predication数据库获取活性成分靶点信息。在GeneCards和DisGeNET数据库获取流感相关靶点,使用Venny平台对淡豆豉活性成分和流感相关靶点取交集并构建药物-成分-靶点-疾病网络图。利用Cytoscape软件建立可视化蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),利用David数据库和R语言进行GO富集分析和KEGG通路与基因功能富集分析及网络可视化。通过细胞实验对重要信号通路进行验证。结果:淡豆豉的主要成分为6"-O-乙酰基苷、大豆黄素、黄豆苷元、染料木素和异黄酮、等,在其中共筛选出7个有效成分,涉及靶点868个;流感相关靶点303个,二者交集靶点47个,涉及的关键靶点有:热休克蛋白90 AA1(Hsp90AA1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)、等;GO分析作用靶点主要富集在蛋白结合、蛋白激酶调节过程;KEGG分析得到关键通路包括:流感病毒信号通路、凋亡信号通路、Toll信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、等。细胞实验结果证实,与模型对照组相比较,淡豆豉水煎液1.6、8 mg/mL组可通过直接作用方式降低24 h后病毒蛋白表达和子代病毒产生量(P<0.05);与模型对照组相比,淡豆豉煎出液8 mg/mL组作用24 h和36 h组的热休克蛋白90(Hsp90)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)及半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9(caspase 9)的mRNA转录水平下调(P<0.05),Hsp90、Caspase 3 mRNA及Caspase 3剪切体蛋白表达水平明显下调,细胞凋亡率均明显降低(P<0.05)。结论:淡豆豉通过与宿主细胞相关靶点相互作用影响病毒的感染、病毒基因组的复制、转录、翻译过程或调控细胞凋亡发挥抗流感作用。

关键词：淡豆豉流感病毒子代病毒半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3 热休克蛋白90

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细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂应用的研究进展

中国生物制品学杂志 2023年第6期36卷 764-768页

作者：项婷婷(综述) 马淑敏(综述) 沃恩康(审校) 杭州医学院检验医学院生物工程学院浙江杭州310013

疫苗在传染性疾病预防控制中发挥重要作用。细菌鞭毛蛋白能激活宿主细胞Toll样受体5(Toll like receptor 5,TLR5)和NOD样受体C4(NOD like receptor C4,NLRC4),具有免疫佐剂效应。作为新型免疫佐剂,鞭毛蛋白既能与抗原蛋白共同作用,又能... 详细信息

疫苗在传染性疾病预防控制中发挥重要作用。细菌鞭毛蛋白能激活宿主细胞Toll样受体5(Toll like receptor 5,TLR5)和NOD样受体C4(NOD like receptor C4,NLRC4),具有免疫佐剂效应。作为新型免疫佐剂,鞭毛蛋白既能与抗原蛋白共同作用,又能与抗原蛋白融合表达,均能显著提高免疫效果;同时,其在黏膜免疫和抗肿瘤免疫中也取得较好的应用效果,成为疫苗佐剂研发的热点。本文主要就细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂应用的研究进展作一综述,以期为鞭毛蛋白佐剂疫苗的研发提供新思路。

关键词：鞭毛蛋白佐剂疫苗细菌融合蛋白

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艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及挑战

中国生物制品学杂志 2023年第9期36卷 1138-1142页

作者：陶薇傅婷(综述) 洪艳(审校) 杭州医学院检验医学院、生物工程学院浙江杭州310013

艰难梭菌(Clostridiodes difficile,C.difficile)是全球最常见引起抗生素相关腹泻(antibiotic-associated diarrhea,ADD)的病因。近年来,随着具有高抗药性和高毒力菌株的出现,造成多次艰难梭菌感染全球流行。艰难梭菌感染发病率、复发... 详细信息

艰难梭菌(Clostridiodes difficile,C.difficile)是全球最常见引起抗生素相关腹泻(antibiotic-associated diarrhea,ADD)的病因。近年来,随着具有高抗药性和高毒力菌株的出现,造成多次艰难梭菌感染全球流行。艰难梭菌感染发病率、复发率和死亡率在全球范围内呈上升趋势,为临床治疗带来极大挑战。致病性菌株主要产生两种同源性糖基化毒素A和B,会造成从腹泻到高致死的中毒型巨结肠等症状。鉴于艰难梭菌感染造成的恶性后果,疾病的预防仍然是值得探索的重要途径。目前尚无获得使用许可的艰难梭菌疫苗,因此本文对艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及面临的挑战作一综述。

关键词：艰难梭菌抗生素相关腹泻疫苗内毒素单克隆抗体

壳聚糖及季铵化壳聚糖作为疫苗佐剂的研究进展

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中国生物制品学杂志 2024年第2期37卷 234-238页

作者：马淑敏项婷婷(综述) 沃恩康(审校) 杭州医学院检验医学院生物工程学院浙江杭州310013

佐剂是当前诸多新型疫苗发挥保护作用的关键因素。佐剂的添加既可减少抗原使用量,又可增加抗原的免疫原性,激发机体强有力的免疫反应。壳聚糖作为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物,具有黏附性、渗透性、生物相容性等特性,其有作为疫... 详细信息

佐剂是当前诸多新型疫苗发挥保护作用的关键因素。佐剂的添加既可减少抗原使用量,又可增加抗原的免疫原性,激发机体强有力的免疫反应。壳聚糖作为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物,具有黏附性、渗透性、生物相容性等特性,其有作为疫苗佐剂的优势,被广泛研究和应用。壳聚糖作为新型佐剂不仅可协助诱导细胞免疫和体液免疫,也可激活黏膜免疫。本文就壳聚糖及季铵化壳聚糖作为疫苗佐剂的最新研究进展以及相关机制作一综述。

关键词：壳聚糖季铵化壳聚糖疫苗佐剂黏膜免疫

OxyR介导的细菌氧化胁迫应答调控机制研究进展

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微生物学报 2023年第4期63卷 1392-1403页

作者：洪晓丽杨倩雯音建华万芬杭州医学院检验医学院/生物工程学院浙江杭州310053 浙江工业大学生物工程学院浙江杭州310014

OxyR属于LysR型转录因子家族的氧化胁迫调控蛋白,是细菌抵抗氧化胁迫压力的重要调控因子。OxyR能够通过调控过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化基因的表达清除H_(2)O_(2)、参与铁代谢控制胞内过氧化物的产生以及修复生物大分子氧化损伤,从... 详细信息

OxyR属于LysR型转录因子家族的氧化胁迫调控蛋白,是细菌抵抗氧化胁迫压力的重要调控因子。OxyR能够通过调控过氧化氢酶和过氧化物酶等抗氧化基因的表达清除H_(2)O_(2)、参与铁代谢控制胞内过氧化物的产生以及修复生物大分子氧化损伤,从而抵抗氧化胁迫。OxyR的基因表达调控功能依赖于其还原态和氧化态之间的转变,改变调控蛋白对下游基因调控区的亲和能力。氧化态OxyR识别启动子区的结合序列,激活或抑制过氧化氢酶等基因的表达。还原态和氧化态的转换依赖于在氧化状态下分子间二硫键的形成。本文综述了近年来细菌OxyR调控基因表达的最新研究进展,有助于深入理解OxyR在细菌抵抗氧化胁迫的作用方式,为相关致病菌的防治奠定分子基础。

关键词：氧化胁迫 OxyR 过氧化氢酶基因表达调控

基于流感病毒M2蛋白胞外区的双层蛋白质纳米颗粒的制备及免疫学效果评价

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国际流行病学传染病学杂志 2023年第6期50卷 378-385页

作者：马淑敏项婷婷何泳愉郭潮潭杨灿杨新燕胡珂昕沃恩康杭州医学院检验医学院、生物工程学院杭州310013

目的通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒, 探究其在小鼠体内的免疫效果。方法采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα... 详细信息

目的通过两步脱溶剂-交联法制备携带流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)、6个串联重复的M2蛋白胞外域(6M2e)和鞭毛蛋白(Flg)的双层蛋白质纳米颗粒, 探究其在小鼠体内的免疫效果。方法采用脱溶剂-交联法将融合蛋白FljB-6M2e-△D2D3-HAα和HAα-6M2e制备成双层蛋白质纳米颗粒。通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪进行物理表征后评估其细胞毒性。免疫小鼠后采用ELISA方法进行特异性抗体效价测定, ELISPOT检测细胞免疫水平, CCK-8法检测脾细胞的增殖情况。结果本研究成功制备了粒径为(130.03±2.96) nm的双层蛋白质纳米颗粒FljB-6M2e-△D2D3-HAα/ HAα-6M2e。免疫小鼠后产生的抗M2e-IgG抗体效价为1∶25 600, 抗HAα-IgG抗体效价为1∶12 800, 高于对照组小鼠, 差异均具有统计学意义(t=3.051和3.780, P=0.038和0.019)。与对照组相比, 多肽刺激可以使小鼠脾细胞显著增殖[M2e刺激增殖率:(154.18±2.34)%, HAα刺激增殖率:(151.51±1.56)%](t=12.942和24.591, P均<0.001), 并且诱导产生分泌更多IL-4和IFN-γ的淋巴细胞(M2e刺激:t=5.477和6.571, P=0.005和0.013;HAα刺激:t=9.239和7.671, P=0.001和0.013)。多种细胞因子的mRNA水平显著升高, IFN-γ和IL-4的转录水平均高于对照组(IFN-γ:t=13.253和20.847, P均<0.001;IL-4 :t=6.032和4.824, P=0.004和0.009)。结论本研究所制备的双层蛋白质纳米颗粒可以刺激小鼠产生较高水平的体液和细胞免疫应答, 为开发多表位流感通用疫苗提供了有效依据。

关键词：正黏病毒科流感病毒纳米疫苗鞭毛蛋白佐剂免疫原性

流感病毒血凝素茎部螺旋区和串联重复M2蛋白胞外区域融合蛋白的免疫效果研究

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国际流行病学传染病学杂志 2023年第1期50卷 31-38页

作者：项婷婷马淑敏何泳愉路鑫怡郭潮潭杨灿杨新燕沃恩康杭州医学院检验医学院、生物工程学院杭州310013

目的探索含有流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)和6个串联重复M2蛋白胞外区域(6M2e)的融合蛋白的表达和制备方法,并对其在小鼠体内的免疫效果进行评价。方法采用去除高变区的鞭毛蛋白序列,将HAα和6M2e插入到原高变区位点,构建重组质粒p... 详细信息

目的探索含有流感病毒血凝素茎部α螺旋区(HAα)和6个串联重复M2蛋白胞外区域(6M2e)的融合蛋白的表达和制备方法,并对其在小鼠体内的免疫效果进行评价。方法采用去除高变区的鞭毛蛋白序列,将HAα和6M2e插入到原高变区位点,构建重组质粒pET28a-FljBΔD2D3-HAα-6M2e。在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化和鉴定,并评估其细胞毒性。最后将制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体效价,实时荧光PCR法检测小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-ɑ的mRNA水平,CCK-8法检测脾细胞的增殖。结果成功构建重组质粒pET28a-FljBΔD2D3-HAα-6M2e,蛋白表达最适条件为1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导10 h,通过镍柱纯化获得高纯度的无毒融合蛋白。免疫小鼠后抗M2e-IgG和抗HAα-IgG的抗体ELISA效价均达到1∶102400,且与对照组相比差异有统计学意义(t=0.33,P=0.774;t=7.60,P=0.001)。各类细胞因子的mRNA水平升高,其中实验组IFN-γ转录水平为38.74±3.65,蛋白水平为(66.03±3.31)pg/mL,高于对照组(t=21.33,P=0.003;t=10.21,P<0.01)。结论成功制备了高纯度的融合蛋白FljBΔD2D3-HAα-6M2e,能有效刺激小鼠产生抗M2e-IgG和抗HAα-IgG,具有良好的免疫效果,为流感疫苗候选物研发奠定了基础。

关键词：正黏病毒科流感病毒疫苗融合蛋白免疫原性

基于核酸适配体的光学纳米传感器在食源性致病菌检测中的应用

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食品安全质量检测学报 2023年第15期14卷 101-112页

作者：钟毓红吴佳琪潘小艳刘波王琳浙江大学医学院附属第二医院临床检验中心杭州310009 杭州医学院检验医学院与生物工程学院杭州310059

食源性疾病一直严重威胁着世界各国人民的健康,而病原菌是引起这类疾病的主要原因。快速、简单、灵敏地筛选食源性致病菌对保证食品安全具有重要意义。纳米材料因其光学特性、独特的结构和催化性能、良好的稳定性和优异的穿透性,已成为... 详细信息

食源性疾病一直严重威胁着世界各国人民的健康,而病原菌是引起这类疾病的主要原因。快速、简单、灵敏地筛选食源性致病菌对保证食品安全具有重要意义。纳米材料因其光学特性、独特的结构和催化性能、良好的稳定性和优异的穿透性,已成为近年来光学传感研究的热门课题。作为传感器的信号转换装置和生物识别分子的负载基质,纳米材料具有比表面积大、表面自由能高、生物相容性好、表面官能团丰富等特点。适配体是通过体外筛选的短单链核酸,具有合成简单、稳定性好、亲和力高、选择性强、适用性广等优点,是生物应用中理想的分子受体。利用基于适配体的光学纳米传感器检测食源性致病菌,克服了传统检测方法的耗时费力、难以定量、不便现场检测等缺点,成为当前食源性致病菌快速检测的研究热点。因此,本文综述了食源性疾病的流行现状,基于适配体的光学纳米传感器检测食源性致病菌的最新进展,重点介绍了细菌捕获方法和传感技术,以及它们各自的优势和局限性,提出了该技术在实际应用中面临的挑战和前景,以便促进该领域的进一步发展。

关键词：纳米技术适配体光学传感器食源性致病菌

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淡豆豉水煎液体外抗流感病毒作用

国际流行病学传染病学杂志 2022年第5期49卷 303-308页

作者：何泳愉沃恩康杨新燕杨灿路鑫怡项婷婷马淑敏郭潮潭杭州医学院检验医学院与生物工程学院杭州1310013

目的了解淡豆豉水煎液体外抗流感病毒作用,为抑制病毒的新型中药开发提供基础。方法以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(以下简称PR8病毒)感染狗肾上皮细胞(MDCK)作为模型,应用噻唑兰(MTT)法评估淡豆豉水煎液的安全性。以血液凝集抑制实验和... 详细信息

目的了解淡豆豉水煎液体外抗流感病毒作用,为抑制病毒的新型中药开发提供基础。方法以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(以下简称PR8病毒)感染狗肾上皮细胞(MDCK)作为模型,应用噻唑兰(MTT)法评估淡豆豉水煎液的安全性。以血液凝集抑制实验和神经氨酸酶活性抑制实验检测淡豆豉水煎液对流感病毒吸附和释放的影响。设立PR8病毒+淡豆豉水煎液组和PR8病毒组,以实时荧光定量PCR、Western印迹试验、免疫荧光的方法检测淡豆豉水煎液对病毒基因转录水平和蛋白表达水平的影响。结果6.25 mg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制1 HAU流感病毒的吸附。PR8+淡豆豉水煎液组的子代病毒血凝效价为PR8组的1/8。2000μg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制大于80%的神经氨酸酶活性。在第24小时,PR8+淡豆豉水煎液组的NP和M1基因转录水平分别为3444.52±378.35和98737.80±1643.00;NP、M1a和M2e蛋白表达水平分别为0.39±0.03、0.54±0.01和0.82±0.02,均低于PR8组(t=-16.03、-16.17、-39.26、-272.80和-220.00,P均<0.05)。结论淡豆豉水煎液通过影响流感病毒生命周期的吸附、基因转录和翻译、流感子代病毒释放多个阶段,在体外发挥直接抗流感病毒作用。

关键词：正黏病毒科淡豆豉水煎液中药抗病毒作用病毒生命周期基因转录蛋白表达