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比较CRISPR/Cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响

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中国畜牧杂志 2024年第5期60卷 293-298,338页

作者：邱梅玉张雪梅张宁徐鑫刘明军新疆畜牧科学院生物技术研究所农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室新疆动物生物技术重点实验室新疆乌鲁木齐830000

为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定CRISPR/Cas9和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个(36.32%)。本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,CRISPR/Cas9编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。

关键词： CRISPR-cas9 引导编辑(PE) eGFP基因 FITC-A-Mean Hi-TOM深度测序

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香蕉AP2/ERFs超家族的重新鉴定及在果实采后成熟过程中的差异表达特性

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果树学报 2024年第5期41卷 861-874页

作者：张海波郑云柯付毛妮张建斌贾彩红李新国刘菊华海南大学热带农林学院·热带作物生物育种全国重点实验室海口570228 中国热带农业科学院三亚研究院海南三亚572000 中国热带农业科学院热带生物技术研究所·农业农村部热带生物技术重点实验室海口571101

【目的】在全基因组水平上重新鉴定香蕉A基因组中的AP2/ERF家族成员,研究其在香蕉果实采后成熟过程中的差异表达特性,明确可能参与香蕉果实成熟调控的关键基因。【方法】对香蕉A基因组中AP2/ERF家族成员进行系统进化、结构特征、蛋白质... 详细信息

【目的】在全基因组水平上重新鉴定香蕉A基因组中的AP2/ERF家族成员,研究其在香蕉果实采后成熟过程中的差异表达特性,明确可能参与香蕉果实成熟调控的关键基因。【方法】对香蕉A基因组中AP2/ERF家族成员进行系统进化、结构特征、蛋白质特性、保守结构域分析和两大类主栽品种巴西蕉(AAA)和粉蕉(ABB)果实采后成熟不同阶段的转录组分析。【结果】发现AP2/ERFs家族共有317个家族成员,分为AP2(49个)、ERF(253)和RAV(15)三个亚家族,他们不均匀地分布在染色体上。根据保守结构域和基因结构特征,ERF又分为a、b、c、d、e、f、h、i、j和k共10个亚类。转录组分析结果表明,在巴西蕉果实采后成熟过程中差异表达的AP2/ERFs家族成员有77个,其中高水平表达的有MaERF15、36、42和AP2-28。在粉蕉果实采后成熟过程中差异表达的AP2/ERFs家族成员有74个,其中高水平表达的有MaERF42和AP2-28。同时在巴西蕉和粉蕉果实成熟过程中差异表达的基因有57个,其中高水平表达的基因有MaERF15、42和AP2-28,只在巴西蕉果实中特异表达的有20个,只在粉蕉中特异表达的有17个。【结论】重新鉴定了香蕉AP2/ERFs超家族成员及其在果实后熟过程中的差异表达特性,为系统深入解析香蕉AP2/ERF基因功能奠定了基础,对为调控香蕉果实成熟提供靶标基因具有一定的理论意义。

关键词：香蕉 AP2/ERFs 全基因组分析果实成熟差异表达分析

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油莎豆液泡膜内在蛋白基因CeTIP1;1的克隆与分析

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中国油料作物学报 2024年

作者：郑玉皎赵永国常丽丽邹智海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室/中国热带农业科学院热带生物技术研究所/三亚研究院

液泡膜内在蛋白（TIP）是一类定位在液泡上具有高效水分转运活性的水通道蛋白，其在植物的生长发育及逆境响应中发挥重要作用。油莎豆起源于非洲和地中海沿岸，是迄今唯一已知在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。研究基于油莎... 详细信息

液泡膜内在蛋白（TIP）是一类定位在液泡上具有高效水分转运活性的水通道蛋白，其在植物的生长发育及逆境响应中发挥重要作用。油莎豆起源于非洲和地中海沿岸，是迄今唯一已知在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。研究基于油莎豆的基因组和转录组数据对一个块茎高水平表达的TIP基因进行了克隆和鉴定。序列分析显示，CeTIP1;1包含2个内含子，编码区长756 bp，编码251个氨基酸，含有一个水通道蛋白特有的MIP结构域，分子量为25.75 kDa、等电点为6.01、不稳定系数为24.90、总平均疏水指数为0.831、脂肪族指数为107.77，属于稳定的酸性疏水型蛋白。进化分析显示，CeTIP1;1与水稻的OsTIP1;1聚在一起，序列相似性高达92.83%，支持其归为TIP1亚类。亚细胞定位分析显示，CeTIP1;1定位在烟草叶片的液泡膜。表达分析显示，CeTIP1;1组成型表达，其在分析的所有组织中均高水平表达；在块茎的发育过程中，基因呈现先升后降的近钟形趋势。这些结果为深入解析油莎豆块茎的水分平衡机制奠定了坚实的基础。

关键词：油莎豆块茎水通道蛋白亚细胞定位液泡表达模式

绵羊基质Gla蛋白基因克隆、表达谱及其在卵巢组织的定位

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江苏农业学报 2024年第7期40卷 1276-1284页

作者：张欣如古丽米热·阿不都热依木陈莹马秀玲林嘉鹏汪立芹黄俊成吴阳升农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室/新疆动物生物技术重点实验室/新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆乌鲁木齐830011 新疆农业大学动物科学学院新疆乌鲁木齐830052

本研究旨在克隆绵羊基质Gla蛋白(MGP)基因的蛋白质编码序列(CDS),制备特异抗体,并检测该基因在绵羊卵巢组织中的表达分布。以卵泡总cDNA为模板,扩增获得绵羊MGP基因CDS区全长序列;合成绵羊MGP蛋白C末端15个氨基酸长度的多肽,免疫小鼠,... 详细信息

本研究旨在克隆绵羊基质Gla蛋白(MGP)基因的蛋白质编码序列(CDS),制备特异抗体,并检测该基因在绵羊卵巢组织中的表达分布。以卵泡总cDNA为模板,扩增获得绵羊MGP基因CDS区全长序列;合成绵羊MGP蛋白C末端15个氨基酸长度的多肽,免疫小鼠,制备抗血清;利用实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹技术分析其在不同组织和不同大小的卵泡中的表达水平;通过免疫组织化学方法分析其在卵巢组织中的表达分布特征。结果表明,成功获得绵羊MGP基因的CDS区全长片段(467 bp),编码103个氨基酸,理论相对分子量为12230.96,等电点为9.27;N末端19个氨基酸序列被预测为信号肽序列,成熟肽有84个氨基酸,为外泌性蛋白质,无胞内区;MGP总蛋白质氨基酸序列与山羊、牛的同源蛋白质相似性分别为100.0%、99.0%,与人、小鼠的相似性均为85.4%。MGP mRNA和蛋白质在绵羊心、肝、脾、肺、肾等组织中的相对表达量较低,在卵巢、输卵管、子宫等生殖系统或组织中的相对表达量较高,在黄体中的相对表达量也较高;MGP在卵巢组织颗粒细胞、卵丘细胞中均有表达,但在闭锁卵泡中不表达。本研究结果可为进一步研究MGP在卵巢组织中的生物学功能提供参考。

关键词：基质Gla蛋白绵羊卵巢颗粒细胞黄体

胡麻P5CS基因家族进化模式分析及LusP5CS1基因耐旱能力验证

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作物学报 2024年第10期 2515-2527页

作者：王玲张艳萍齐燕妮汪磊李玉骁谭美莲汪魏中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室甘肃省农业科学院生物技术研究所甘肃省农业科学院作物研究所

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物中由P5CS基因编码的一种与干旱胁迫响应紧密联系的关键酶,它主要负责调节脯氨酸的生物合成。研究胡麻P5CS基因家族进化模式对进一步探索其在胡麻耐旱过程中的作用机制具有重要意义。本研究以拟南芥的2个... 详细信息

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物中由P5CS基因编码的一种与干旱胁迫响应紧密联系的关键酶,它主要负责调节脯氨酸的生物合成。研究胡麻P5CS基因家族进化模式对进一步探索其在胡麻耐旱过程中的作用机制具有重要意义。本研究以拟南芥的2个P5CS基因作为查询序列,从胡麻、油菜、大豆、花生、向日葵、水稻、小麦等主要粮油作物的基因组中筛选获得P5CS基因家族成员。并通过分析不同作物P5CS基因受选择压力的大小、位点及功能分化潜力等阐明其进化模式,并在拟南芥中对其进行功能验证。研究结果显示,与其他作物的同源基因相比,胡麻P5CS基因家族成员在基因结构和进化模式上存在显著差异。在拟南芥中过表达受正向选择的胡麻LusP5CS1基因可以显著增加转基因拟南芥脯氨酸的积累并增强其耐旱性;在非干旱胁迫下过表达转基因拟南芥也表现出明显的适合度优势。本研究为胡麻耐旱分子机制和抗旱育种提供了理论基础。

关键词：胡麻 P5CS基因家族系统发育分析基因复制功能分化

葡萄致腐菌灰葡萄孢及其拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定

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江苏农业科学 2024年第15期 144-153页

作者：刘萍牛新湘管力慧杨红梅楚敏包慧芳王宁詹发强林青杨蓉龙宣杞娄恺史应武新疆农业科学院微生物应用研究所新疆大学生命科学与技术学院新疆特殊环境微生物实验室新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室

分离筛选出对葡萄致腐菌灰葡萄孢有较强拮抗作用的拮抗菌，丰富葡萄采后保鲜拮抗菌资源，以期为葡萄灰霉病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础。利用组织块分离法在腐烂的葡萄果实中分离得到灰葡萄孢，梯度稀释法从葡萄园土壤中分离... 详细信息

分离筛选出对葡萄致腐菌灰葡萄孢有较强拮抗作用的拮抗菌，丰富葡萄采后保鲜拮抗菌资源，以期为葡萄灰霉病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础。利用组织块分离法在腐烂的葡萄果实中分离得到灰葡萄孢，梯度稀释法从葡萄园土壤中分离得到潜力拮抗菌，通过平板对峙及琼脂扩散法筛选出拮抗作用较强的生防菌，并通过形态学观察、生理生化测定、生物学鉴定确定其种属。通过对拮抗菌进行溶血性测定初步探索其是否对人体有溶血作用。分离得到的葡萄致腐菌通过形态学观察，病原菌PH-23菌丝初期呈灰白色，继续培养会逐渐转变为淡淡的青灰褐色，菌丝繁盛，孢子众多。对病原菌PH-23进行ITS、β-tub序列分析，结合形态学特征确定其为灰葡萄孢。致病力测定结果表明，PH-23接种后葡萄症状与葡萄灰霉病症状相符，腐烂严重。筛选得到对葡萄致腐菌PH-23拮抗作用较强的生防菌TP-1,抑菌圈直径为22.49 mm。通过形态学观察，菌体为杆状，芽孢呈椭圆形，大小为0.62μm×2.35μm。TP-1革兰氏染色阳性。生理生化鉴定结果初步认为TP-1为芽孢杆菌。基于16S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。拮抗菌TP-1的溶血性测定显示其对人体无溶血作用。拮抗菌TP-1对灰葡萄孢有较强的拮抗作用，在葡萄采后贮藏及生物保鲜中具有潜在的应用价值。

关键词：葡萄灰霉病灰葡萄孢生物防治生理生化鉴定拮抗菌

玉米穗发芽突变体vp2的基因克隆及功能研究

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作物学报 2024年

作者：张馨月秦阳李瑞黄全生王逸茹郑军青岛农业大学农学院中国农业科学院作物科学研究所甘肃农业大学农学院新疆农业科学院核技术生物技术研究所

玉米穗发芽是指籽粒在果穗上未脱离母体时胚芽便开始萌发生长，穗发芽会严重影响玉米的产量和品质。因此高效挖掘和利用优良基因，培育抗穗发芽玉米品种对我国农业生产非常重要。本研究中的玉米穗发芽突变体vp2具有明显的穗发芽表型且... 详细信息

玉米穗发芽是指籽粒在果穗上未脱离母体时胚芽便开始萌发生长，穗发芽会严重影响玉米的产量和品质。因此高效挖掘和利用优良基因，培育抗穗发芽玉米品种对我国农业生产非常重要。本研究中的玉米穗发芽突变体vp2具有明显的穗发芽表型且性状能稳定遗传，受隐性单基因控制。通过分析vp2突变体基因组序列发现突变体中两个编码基因(Zm00001d015355和Zm00001d015356)存在缺失，Zm00001d015356编码对羟基苯丙酮酸双加氧酶(ZmHPPD1)。hppd1突变体表现穗发芽表型，且与vp2杂交后代中正常与穗发芽籽粒符合3∶1遗传分离比，结果表明Vp2编码ZmHPPD1基因。为进一步分析ZmHPPD1调控籽粒穗发芽的机制，我们检测了突变体中内源激素和ABA合成通路代谢物含量的变化，发现与正常籽粒相比，穗发芽籽粒中ABA含量显著下降，八氢番茄红素显著积累，且紫黄质、玉米黄质和叶黄素含量显著降低。这表明ZmHPPD1通过影响八氢番茄红素向番茄红素的转化，使ABA合成受阻，导致玉米籽粒打破休眠提前萌发。以上研究结果为解析玉米穗发芽的机制提供了基因资源。

关键词：玉米穗发芽植物激素脱落酸

亚洲玉米螟越冬后幼虫致病细菌——黏质沙雷氏菌的分离鉴定及杀虫活性评价

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中国生物防治学报 2024年第2期40卷 310-318页

作者：袁梓涵王小武丁新华付开赟蒋旭东巩雪花贾尊尊吐尔逊·阿合买提郭文超新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052 新疆农业科学院植物保护研究所乌鲁木齐830091 新疆农业生物安全重点实验室新疆乌鲁木齐830091

本研究从新疆伊犁河谷新源县春播玉米田越冬后自然罹病亚洲玉米螟幼虫上分离获得1株细菌菌株ACB3014,通过形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定,并采用饲喂法测定了该菌株对亚洲玉米螟3龄幼虫的致病性。结果... 详细信息

本研究从新疆伊犁河谷新源县春播玉米田越冬后自然罹病亚洲玉米螟幼虫上分离获得1株细菌菌株ACB3014,通过形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定,并采用饲喂法测定了该菌株对亚洲玉米螟3龄幼虫的致病性。结果表明菌株ACB3014为黏质沙雷氏菌Serratia marcescens。菌株ACB3014对亚洲玉米螟3龄幼虫的累积校正死亡率随菌悬液浓度的升高而增加。饲喂ACB3014菌悬液后第7 d,在浓度2×10^(4)~2×10^(8)cfu/mL下,亚洲玉米螟3龄幼虫的累积校正死亡率为27.78%~77.78%。接种第13 d,亚洲玉米螟3龄幼虫LC_(50)为3.79×10^(3)cfu/mL,当浓度达2×10^(8)cfu/mL时,LT_(50)为3.93 d。且染病后的亚洲玉米螟体色为暗红色和黑色,虫体呈脓状溃烂,散发出强烈异味。综上,黏质沙雷氏菌ACB3014菌株对亚洲玉米螟幼虫有很好的杀虫活性,具有很高的防治潜力,可用作亚洲玉米螟的绿色生物防治资源。

关键词：亚洲玉米螟黏质沙雷氏菌毒力测定致病力杀虫活性

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红绶曲霉ACB1042与四种酰胺类杀虫剂的相容性及其对亚洲玉米螟的室内联合毒力

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昆虫学报 2024年第7期67卷 943-953页

作者：袁梓涵王小武丁新华付开赟贾尊尊郭文超新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052 新疆农业科学院植物保护研究所乌鲁木齐830091 新疆农业生物安全重点实验室乌鲁木齐830091

【目的】明确红绶曲霉Aspergillus nomius ACB1042与4种酰胺类杀虫剂的相容性及混配后对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的毒力。【方法】以4种酰胺类杀虫剂20%氯虫苯甲酰胺SC(悬浮剂)、10%溴氰虫酰胺OF(油悬剂)、10%四氯虫酰胺SC和20%... 详细信息

【目的】明确红绶曲霉Aspergillus nomius ACB1042与4种酰胺类杀虫剂的相容性及混配后对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的毒力。【方法】以4种酰胺类杀虫剂20%氯虫苯甲酰胺SC(悬浮剂)、10%溴氰虫酰胺OF(油悬剂)、10%四氯虫酰胺SC和20%四唑虫酰胺SC的田间推荐浓度为初始浓度,采用血球计数法和十字交叉法分别测定这4种杀虫剂对红绶曲霉ACB1042孢子萌发抑制率、菌丝生长抑制率和产孢抑制率的影响;通过喷雾法测定红绶曲霉ACB1042和20%四唑虫酰胺SC对亚洲玉米螟3龄幼虫的致死中浓度(median lethal concentration,LC_(50))值以及LC_(50)的红绶曲霉ACB1042与LC_(50)的20%四唑虫酰胺SC以体积比9∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶9混配处理对亚洲玉米螟3龄幼虫的室内联合毒力,测定LC_(50)的20%四唑虫酰胺SC与LC_(50)的红绶曲霉ACB1042以体积比4∶1混剂处理玉米螟3龄幼虫后于24,48,72,96和120 h体内过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性。【结果】4种杀虫剂在田间推荐浓度下对红绶曲霉ACB1042的孢子萌发率、菌丝生长速率和产孢量均有一定的抑制作用,随着杀虫剂稀释倍数增加,抑制作用减弱,其中20%四唑虫酰胺SC 10倍稀释浓度(0.1 RC)与红绶曲霉ACB1042具有较好的相容性:红绶曲霉ACB1042孢子萌发抑制率、产孢抑制率和9 d菌丝生长抑制率依次为0,2.15%和0.78%。红绶曲霉ACB1042与20%四唑虫酰胺SC以不同体积比混配后的共毒系数(co-toxicity coefficient,CTC)均大于120,其中20%四唑虫酰胺SC与红绶曲霉ACB1042以体积比4∶1混用后协同增效作用最好,对亚洲玉米螟3龄幼虫的LC_(50)值为2.359 mg/L,CTC高达365;红绶曲霉ACB1042与20%四唑虫酰胺SC混剂处理后亚洲玉米螟3龄幼虫体内POD,SOD,CAT,PPO,CarE和GST活性随着处理时间推移均呈先上升后下降的趋势。【结论】在田间防治亚洲玉米螟时,可利用红绶曲霉ACB1042与低浓度的20%四唑虫酰胺SC混配,从而达到增效作用。

关键词：亚洲玉米螟红绶曲霉酰胺类杀虫剂相容性联合毒力增效作用