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重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 745-750页

作者：杜天飞容新宗杨盛理张勇侠高雅丽武志强李春阳刘兰军成都生物制品研究所有限责任公司四川省疫苗工程技术研究中心四川成都610023

目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 ... 详细信息

目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 S基因,优化引物浓度,建立qPCR检测方法。对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR法对生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数进行检测。结果选择引物浓度为0.20μmol/L建立qPCR方法。该方法能特异性检测SARS-CoV-2 S基因拷贝数;模板浓度在2×10^(2)~2×10^(8)copies/μL之间,线性关系良好(R^(2)=0.995),检测下限为2×10^(2)copies/μL;6次重复检测重组病毒S基因拷贝数的变异系数(coefficient of variation,CV)为2.64%。应用建立的qPCR法检测生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数的结果与细胞病变法检测结果基本一致。结论建立的qPCR法专属性和重复性良好,可用于重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度检测。

关键词：荧光定量PCR 重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗 S基因病毒滴度

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乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴定方法专属性研究

国际生物制品学杂志 2024年第2期47卷 63-66页

作者：廖海棠马玉晓彭维江虹霞曾兰义罗明杰吕冰凌刘菊成都生物制品研究所有限责任公司质量检定室成都610023 四川省疫苗工程技术研究中心成都610023

目的研究乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗冻干稳定剂中各组分(蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶)对病毒滴定方法(噬斑法)的影响,进一步确定该方法的专属性。方法采用噬斑法对不同浓度的乙脑疫苗稳定剂各组分分别进行滴定,考察各组分对BH... 详细信息

目的研究乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗冻干稳定剂中各组分(蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶)对病毒滴定方法(噬斑法)的影响,进一步确定该方法的专属性。方法采用噬斑法对不同浓度的乙脑疫苗稳定剂各组分分别进行滴定,考察各组分对BHK21细胞的影响。取3批乙脑疫苗原液与稳定剂各组分分别混合为实验组,与病毒稀释液混合为对照组,采用噬斑法检测实验组与对照组的病毒滴度并进行统计分析。结果稳定剂中各组分对BHK21细胞无影响。将乙脑病毒完全中和后,细胞板上没有噬斑形成。实验组与对照组病毒滴度差异无统计学意义,t值分别为蔗糖乳糖溶液0.24,明胶-0.09,尿素-0.15,人血白蛋白-0.05,P值均大于0.05。结论噬斑法检测乙脑病毒的专属性良好,可用于乙脑疫苗的病毒滴度检测。

关键词：日本脑炎疫苗滴定分析法噬斑法专属性

6种复合固定液对金黄仓鼠视网膜组织固定效果的比较

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实验动物与比较医学 2024年

作者：吴海凤周小江李晨江李怀银高明兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心

目的比较6种固定液对金黄地鼠视网膜组织石蜡切片的影响，优化金黄地鼠视网膜组织石蜡切片固定方法。方法取18只雄性SPF级金黄地鼠，随机分为6组，每组3只。分别使用质量分数4%多聚甲醛、Bouin’s、Carnoy、Davidson’s、Zenker和Hell... 详细信息

目的比较6种固定液对金黄地鼠视网膜组织石蜡切片的影响，优化金黄地鼠视网膜组织石蜡切片固定方法。方法取18只雄性SPF级金黄地鼠，随机分为6组，每组3只。分别使用质量分数4%多聚甲醛、Bouin’s、Carnoy、Davidson’s、Zenker和Helly溶液进行心脏灌注，将眼球组织取出后制作眼杯，投入相应固定液中固定，48 h后制作石蜡切片并进行HE染色。光学显微镜下观察组织细胞的形态学特征并进行双盲法评分，统计学方法分析固定效果和染色质量。结果各组切片镜下观察结果显示：Davidson’s溶液固定的切片视网膜完整无断裂，各层结构清晰，细胞核形态良好，视网膜与巩膜、色素膜连接紧密。经4%多聚甲醛、Bouin’s和Carnoy溶液固定的切片均有视网膜不同程度的断裂、视网膜与巩膜脱离现象。Zenker和Helly溶液固定的切片质量最差，视网膜组织脱落明显，裂隙大，各层细胞不清晰，染色淡。双盲法评分后经SPSS 27.0分析得出Davidson’s溶液染色效果最佳，4%多聚甲醛和Bouin’s固定液染色效果仅次于Davidson’s固定液，Carnoy固定液染色效果较差，Zenker固定液和Helly固定液染色效果最差，Zenker固定液和Helly固定液组与其它组比较在统计学上有显著性差异（P<0.05）。结论金黄地鼠视网膜组织推荐固定首选Davidson’s溶液，其次为4%多聚甲醛固定液、 Bouin’s固定液和Carnoy固定液。

关键词：固定液金黄地鼠视网膜石蜡切片

3种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法比较

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国际生物制品学杂志 2024年第4期47卷 217-222页

作者：杜天飞于晓萍李春阳刘兰军成都生物制品研究所有限责任公司重组蛋白质药物及新疫苗研究室四川省疫苗工程技术研究中心成都610023

目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方... 详细信息

目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方法及基于人白血病T细胞株(Jurkat细胞)的淋巴细胞毒流式检测方法测定3批次免疫血清及3批次原液的效价。免疫血清稀释128、256及512倍进行效价检测, 判定效价;原液稀释8~2 048倍进行检测, 计算半数效应浓度。结果中国药典方法与基于人外周血单个核细胞流式法检测3批次免疫血清的效价均为1∶512;基于Jurkat细胞流式法检测001批次免疫血清的效价为1∶512, 002与003批次免疫血清的效价为1∶256。3种方法测定3批次原液的效价结果与阳性对照Grafalon的活性水平相当, 不同方法检测的效价趋势基本一致。结论虽然3种方法测定免疫血清与原液的效价结果趋势基本一致, 但淋巴细胞毒流式检测方法操作更便捷, 且可定量测定半数效应浓度值。

关键词：抗人T淋巴细胞免疫球蛋白流式细胞术淋巴细胞毒效价

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除菌过滤在轮状病毒疫苗工艺中的初步应用

中国医药工业杂志 2024年

作者：童彦军陈同伏署光贺倩马超李佳林兰州生物制品研究所有限责任公司疫苗一室甘肃省疫苗工程技术研究中心

为了考察三价轮状病毒疫苗半成品工艺优化中除菌过滤对产品质量属性的影响，评估除菌过滤在半成品工艺中应用的可行性，该研究分2个阶段进行了22批的半成品过滤试验。试验滤膜孔径为0.22 μm，材质为聚偏二氟乙烯，考察除菌过滤对试验... 详细信息

为了考察三价轮状病毒疫苗半成品工艺优化中除菌过滤对产品质量属性的影响，评估除菌过滤在半成品工艺中应用的可行性，该研究分2个阶段进行了22批的半成品过滤试验。试验滤膜孔径为0.22 μm，材质为聚偏二氟乙烯，考察除菌过滤对试验产品病毒滴度及外观、pH、渗透压和澄清度的影响，并对拟选定的滤膜材质进行细菌截留试验。结果显示，采用聚偏二氟乙烯、孔径为0.22 μm的除菌滤器进行三价轮状病毒疫苗半成品除菌过滤后，对试验产品的病毒滴度和理化特性如外观、pH和渗透压的影响差异性不显著(P>0.05)，但能显著提高试验产品的澄清度(P＜0.05)。该研究为三价轮状病毒疫苗半成品配制工艺增加除菌过滤积累了关键数据和经验。

关键词：三价轮状病毒疫苗半成品除菌过滤细菌截留试验

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两种汉逊酵母细胞高压匀浆破碎方式的比较

中国生物制品学杂志 2024年第10期 1214-1217+1224页

作者：王玢杨林鹏陈卓涛周晖国邵志伟马素娟杨千苇李薇杨俊杰兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心

目的比较分步和循环2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果，以期为今后汉逊酵母细胞工业化规模生产破碎方式的选择提供实验依据。方法采用分步和循环2种高压匀浆破碎方式对3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液进行破碎，取破碎前后样... 详细信息

目的比较分步和循环2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果，以期为今后汉逊酵母细胞工业化规模生产破碎方式的选择提供实验依据。方法采用分步和循环2种高压匀浆破碎方式对3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液进行破碎，取破碎前后样品，置光学显微镜下观察细胞形态，检测宿主蛋白含量、细胞破碎率、蛋白释出度、释出蛋白粒径分布等指标，并进行比较。结果分步和循环破碎2种高压匀浆破碎方式破碎3批汉逊酵母细胞浓缩发酵液后，完整细胞数量减少，细胞碎片增多，但细胞形态未见明显差异；宿主蛋白含量（平均灰度值分别为115.259和109.125）、细胞破碎率（均值分别为60.29%和58.96%）、蛋白释出度（均值分别为39.55%和37.28%）、释出蛋白粒径分布（分步方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在90.41和525.07 nm处,分别占样品蛋白含量的31.37%和68.63%；循环方式破碎后释出蛋白粒径平均分布在109.11和547.37 nm处，分别占样品蛋白含量的29.93%和70.07%）的差异均无统计学意义（F分别为1.054、1.159、4.245、8.875,t分别为1.036 0、0.504 1、0.605 0、0.139 7,P均<0.05）。结论循环和分步2种高压匀浆破碎方式对汉逊酵母细胞的破碎效果相当，但循环破碎方式更简便，且可避免污染风险，更适用于工业化规模生产汉逊酵母细胞的破碎。

关键词：汉逊酵母高压均质破碎分步破碎循环破碎

重组猪胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中的应用

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微生物学免疫学进展 2024年第1期52卷 17-22页

作者：肖蕾刘晓巍张志刚马树奇杨俊杰徐小明张艳李红芳兰州生物制品研究所有限责任公司疫苗二室、甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的探究重组猪胰酶(recombinant porcine trypsin, RPT)代替猪源胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产中的可能性。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,用4种不同浓度(0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL)的重组猪胰酶消化原代地鼠肾(primar... 详细信息

目的探究重组猪胰酶(recombinant porcine trypsin, RPT)代替猪源胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产中的可能性。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,用4种不同浓度(0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL)的重组猪胰酶消化原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,比较细胞总数、细胞活率以及培养6 d的细胞形态,筛选出最佳重组猪胰酶的工作浓度;对消化液A(含0.30%柠檬酸钠的0.30 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.15 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)消化效果进行对比,选择合适的消化液;对P1代PHK细胞接种狂犬病病毒aG株,确定最佳病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI);对不同胰酶消化的细胞接种狂犬病病毒aG株,并比较两者病毒滴度。结果重组猪胰酶对原代PHK细胞消化的最佳浓度为0.10 mg/mL,消化液A更适用于P1代PHK细胞的消化,细胞培养6 d后形成致密单层,胞体饱满;最佳MOI范围为0.10~0.50,且试验具有高度重复性;镜下观察细胞病变无明显变化,但是重组猪胰酶消化后的细胞比猪源胰酶脱落较少,肉眼可见病毒收获液更澄清;2种胰酶消化制备的P1代PHK细胞病毒滴度差异无统计学意义(P=0.630,P>0.05)。结论重组猪胰酶可以替代猪源胰酶用于制备冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞),为冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进奠定基础。

关键词：重组猪胰酶原代地鼠肾细胞狂犬病病毒消化液疫苗制备

两种AH100-ATS高压均质机在汉逊酵母细胞破碎中适用性的研究

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微生物学免疫学进展 2024年第1期52卷 48-54页

作者：王玢邵志伟杨林鹏陈卓涛马素娟杨千苇周静李薇杨俊杰周晖国兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的评价150型AH100-ATS高压均质机和40型AH100-ATS高压均质机在汉逊酵母细胞破碎中的适用性。方法用2种AH100-ATS高压均质机分别重复破碎3组汉逊酵母,每组细胞破碎3次,光学显微镜下观察并比较2种高压均质机破碎汉逊酵母细胞前后的形... 详细信息

目的评价150型AH100-ATS高压均质机和40型AH100-ATS高压均质机在汉逊酵母细胞破碎中的适用性。方法用2种AH100-ATS高压均质机分别重复破碎3组汉逊酵母,每组细胞破碎3次,光学显微镜下观察并比较2种高压均质机破碎汉逊酵母细胞前后的形态;SDS-PAGE电泳检测破碎后细胞中目的蛋白的释出;血球计数板计数且计算破碎后的细胞破碎率;Bradford法检测及计算蛋白释出度;计时破碎所需要的时间。结果光学显微镜下,2种高压均质机破碎汉逊酵母细胞前后的细胞形态均可见明显差别;150型AH100-ATS高压均质机破碎汉逊酵母细胞后释出蛋白的粒径分布体积比高于40型AH100-ATS高压均质机,差异有统计学意义(P研究中汉逊酵母细胞的破碎,且较40型AH100B-ATS高压均质机破碎需要更短的时间,且具有更好的破碎效果。

关键词：高压均质机汉逊酵母细胞高压均质破碎细胞破碎率蛋白释出度破碎时间

基于QbD理念的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺开发

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 710-717页

作者：徐世友白彩虹孙田华易中恒李薇焦磊雷清兰州生物制品研究所有限责任公司、甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的基于质量源于设计(Quality by Design,QbD)理念,开发一种具有较高生物量与较高菌体活力培养特点的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺。方法以不同摇瓶配置为考察因素,菌体悬浮液A600值、培养物湿菌重和菌体活力值为培养结果考察指标,采用... 详细信息

目的基于质量源于设计(Quality by Design,QbD)理念,开发一种具有较高生物量与较高菌体活力培养特点的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺。方法以不同摇瓶配置为考察因素,菌体悬浮液A600值、培养物湿菌重和菌体活力值为培养结果考察指标,采用方差分析分析培养结果以获得具有高生物量和高菌体活力的第3次扩增摇瓶配置。以摇床温度和摇床转速为试验因子进行2因子2水平全因子试验,菌体悬浮液A值为响应值,培养累计时间为变量因素,摇床实时在线温度与摇床设备自测转速为补充变量因素,采用函数型主成分分析(functional principal component analysis,FPCA)方法进行广义回归,拟合生长曲线模型,通过生长曲线模型获得优化后的培养停止时间及培养工艺,对响应值添加随机噪声蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation,MCS),再次优化获得摇床培养工艺设计空间,选择设计空间中最劣条件作为验证试验设定条件,以不同培养停止时间分阶段进行连续10批次验证试验。结果第3次扩增摇瓶配置:5 L一次性高效摇瓶,大面积透气膜盖。培养工艺设计空间:摇床温度36.5~37.5℃,摇床转速220~230 r/min,设计培养停止时间18 h。最劣条件验证试验表明,停止培养时间为16 h时,可获得较高菌体活力值且较低生物量的培养结果,停止培养时间为18 h时,可获得较高水平的生物量及菌体活力值。结论本研究设计的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺具有较高生物量及较高菌体活力培养特点,同时可依据此培养工艺适应性调整以满足不同培养需求。

关键词：大肠埃希菌培养工艺摇瓶方差分析函数型主成分分析质量源于设计