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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

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南方农业学报 2024年第4期55卷 1238-1248页

作者：刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康广西大学动物科学技术学院/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室/广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 详细信息

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

关键词：猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白原核表达多克隆抗体制备间接ELISA

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1株猪源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及致病性研究

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中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2697-2706页

作者：吴钰兴邹潍力程子馨莫玉鹏张凌源纪宛彤陈思宇郑浩东麻润雯李珣李茂宁王晓晔广西大学动物科学技术学院广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西高校动物疫病预防与控制重点实验室南宁530004 广西桂林力源集团桂林541012 重庆市渝东卫生学校重庆408300 桂林市动物疫病预防控制中心桂林541000 东莞市动物疫病预防控制中心东莞523000

【目的】探究A型产气荚膜梭菌在仔猪腹泻中的致病性,为A型产气荚膜梭菌感染所致腹泻的诊断和治疗提供理论依据和参考。【方法】通过培养特性和革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过生化试验、毒素基因PCR扩增、16S rRNA序列比对并构... 详细信息

【目的】探究A型产气荚膜梭菌在仔猪腹泻中的致病性,为A型产气荚膜梭菌感染所致腹泻的诊断和治疗提供理论依据和参考。【方法】通过培养特性和革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过生化试验、毒素基因PCR扩增、16S rRNA序列比对并构建进化树对可疑菌株进一步鉴定,利用药敏试验和动物回归试验研究分离菌株的耐药性和致病性。【结果】分离菌株在TSN平板上呈黑色菌落,在血平板上呈α、β双溶血环,革兰染色呈紫色粗大杆菌。生化试验结果显示,分离菌株葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、还原性硝酸盐试验、H_2S试验和明胶液化均呈阳性,甘露醇、吲哚试验和水杨酸结果呈阴性。16S rRNA序列比对结果显示,分离菌与NCBI数据库中已公布的产气荚膜梭菌16S rRNA基因序列相似性均>99%,鉴定该菌株为产气荚膜梭菌。PCR扩增出plc及cpb2基因,表明该菌株为携带β2毒素的A型产气荚膜梭菌。药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素G、庆大霉素、林可霉素、磺胺异噁唑、环丙沙星、诺氟沙星耐药。动物回归试验结果显示,攻菌后仔猪粪便中可检出大量产气荚膜梭菌,该菌株可引起仔猪腹泻,死亡率达50%;死亡仔猪剖检可见小肠充血、出血、鼓气,从脾脏、小肠中可分离出产气荚膜梭菌,且在损伤严重的空肠肠段中分离出高载量A型产气荚膜梭菌。【结论】本试验成功分离出1株A型产气荚膜梭菌,可引起新生仔猪发病,致病性较强,该研究结果为A型产气荚膜梭菌感染仔猪的诊断、流行病学调查、治疗提供了参考依据。

关键词： A型产气荚膜梭菌新生仔猪分离鉴定致病性

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猪丁型冠状病毒截短S蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第1期54卷 48-55页

作者：秦秋英张政黄夏玲洪大林隆美金陈樱韦祖樟黄伟坚欧阳康广西大学动物科学技术学院广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530005 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530005 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530005

为建立快速、高效检测猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)的血清学方法,构建了pET-32a-S-S1b重组质粒,通过原核表达获得重组S1b蛋白,以此为包被抗原建立了检测血清中PDCoV IgA抗体的间接ELISA方法,对该检测方法的反应条件... 详细信息

为建立快速、高效检测猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)的血清学方法,构建了pET-32a-S-S1b重组质粒,通过原核表达获得重组S1b蛋白,以此为包被抗原建立了检测血清中PDCoV IgA抗体的间接ELISA方法,对该检测方法的反应条件进行优化,验证了其特异性、敏感性和重复性等。结果显示:重组S1b蛋白呈包涵体表达,大小为34.7 ku,反应原性良好;建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:250 ng/孔抗原4℃过夜包被,10 g/L BSA 37℃封闭2 h,待检血清1∶200稀释37℃孵育45 min,二抗1∶10000稀释37℃孵育1 h,显色时间为10 min。测定24份阴性血清,确定临界值为0.388。检测阳性血清敏感度为1∶1600;批间和批内重复试验的变异系数均小于10%;本方法特异性高,与猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪肠病毒标准血清无交叉反应。选取30份血清,与Western-blot检测结果比较,该间接ELISA的符合率为96.66%。应用该方法对486份临床血清样品进行检测,阳性率为32.72%。本研究中建立的方法为PDCoV的防控提供了技术支持。

关键词：猪丁型冠状病毒 S蛋白S1b 间接ELISA 临床检测

基于代谢组学的黄芩水提物防治罗非鱼无乳链球菌病作用机制研究

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黑龙江畜牧兽医 2024年第2期 111-118页

作者：滕婷李原乐韦宏宇陈鑫杜佳璇黄文博李恭贺郑喜邦吴文德广西大学动物科学技术学院南宁530004 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室南宁530004

为了探讨黄芩水提物防治罗非鱼无乳链球菌病的作用机制,试验将104尾体重60 g左右的吉富罗非鱼随机分为4组,分别为空白对照组、阴性对照组、防治组和模型组,每组26尾。阴性对照组和防治组均饲喂含5%黄芩水提物的日粮,空白对照组和模型组... 详细信息

为了探讨黄芩水提物防治罗非鱼无乳链球菌病的作用机制,试验将104尾体重60 g左右的吉富罗非鱼随机分为4组,分别为空白对照组、阴性对照组、防治组和模型组,每组26尾。阴性对照组和防治组均饲喂含5%黄芩水提物的日粮,空白对照组和模型组饲喂基础日粮。于饲喂后第8天进行攻毒试验,空白对照组和阴性对照组腹腔注射灭菌生理盐水,防治组和模型组腹腔注射浓度为1.5×10~9 cfu/mL的无乳链球菌菌液,0.3 mL/尾,观察10 d,试验过程中记录各组临床症状及死亡情况,对濒死的试验鱼进行尾静脉采血,并对死亡试验鱼进行剖检,攻毒试验结束后计算各组的死亡率及5%黄芩水提物对防治组的保护率,并对其他试验鱼进行尾静脉采血。对各组血液进行液相色谱质谱(LC-MS)分析,通过构建主成分分析(PCA)模型和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型筛选差异代谢物,导入京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库后进行通路富集分析。结果表明:攻毒后,空白对照组和阴性对照组食欲佳,未出现异常症状,死亡率均为0,剖检未见明显异常。模型组行动迟缓,食欲减退,体表破溃出血,眼球突出,机体失去平衡,出现侧游或转圈游动等行为;剖检可见肝脏、脾脏、肠组织出现不同程度的水肿、出血,死亡率为95.45%。防治组先是出现与模型组相同的症状,部分鱼死亡,部分鱼症状有所缓解(食欲慢慢恢复正常,精神状态良好),死亡率为46.15%;经计算5%黄芩水提物对罗非鱼的保护率为51.65%。在正负离子模式下5组共检测到7652个离子峰,鉴定到998种代谢物。其中模型组与空白对照组之间的差异代谢物有348种,阴性对照组与空白对照组之间的差异代谢物有257种,治疗组与空白对照组之间的差异代谢物有241种,治疗组与模型组之间的差异代谢物有275种,治疗组与阴性对照组之间的差异代谢物有190种,阴性对照组与模型组之间的差异代谢物有377种。与空白对照组比较,模型组血清中N′-胆酰甘氨酸、喹啉-4,8-二醇、色氨酸、吲哚-3-乙酰胺、5-羟吲哚乙酸、雌二醇-17β-3-硫酸酯、可的松、N′-甲酰基犬尿氨酸、牛磺胆酸相对丰度不同程度降低,19-羟基烯二酮、脱氧皮质酮、11b-羟孕酮相对丰度不同程度升高。给予5%黄芩水提物干预后,防治组这12种代谢物相对丰度均发生了显著或极显著回调(P<0.05或P<0.01、P<0.001)。这个过程涉及色氨酸代谢、类固醇激素的生物合成、胆固醇代谢及胆汁分泌等代谢通路。说明5%黄芩水提物能够有效减轻感染无乳链球菌的罗非鱼的临床症状并降低死亡率,且黄芩主要通过调节色氨酸代谢、类固醇激素的生物合成、胆固醇代谢、胆汁分泌等代谢通路发挥防治罗非鱼无乳链球菌病的作用。

关键词：吉富罗非鱼无乳链球菌黄芩血清代谢组学差异代谢物

2020～2023年广西鸡细小病毒流行病学调查及序列分析

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中国动物传染病学报 2024年

作者：张艳芳谢芝勋范晴谢志勤张民秀谢丽基曾婷婷罗思思黄娇玲李孟王盛吴嫒琼钟传德广西壮族自治区兽医研究所农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室/广西兽医生物技术重点实验室广西玉林市动物疫病预防控制中心

为了解我国广西地区鸡细小病毒（ChPV）的流行现状和遗传进化情况，本研究采用套式PCR技术对2020～2023年间广西地区采集的814份规模化鸡场样品进行ChPV检测，选取3株阳性样品进行全基因测序，将获得的3株全基因和VP1基因序列与27株参... 详细信息

为了解我国广西地区鸡细小病毒（ChPV）的流行现状和遗传进化情况，本研究采用套式PCR技术对2020～2023年间广西地区采集的814份规模化鸡场样品进行ChPV检测，选取3株阳性样品进行全基因测序，将获得的3株全基因和VP1基因序列与27株参考序列进行比对并分析。结果显示，2020～2023年广西部分规模化鸡场ChPV的检出率为46.81%(381/814)。其中ChPV阳性率最高的为肉鸡53.73%（173/322），其次是种鸡46.43%（156/336）和蛋鸡33.33% （52/156）。鸡舍环境样品的ChPV阳性率为38.46%(40/104)。3株ChPV全基因序列有1株属于基因A型，另2株属于基因C型，与参考序列的同源性为78.9%～99.9%。3株ChPV 的VP1基因与参考株核苷酸和氨基酸相似性分别为72.5%～100%和77.9%～100%。通过本次对广西地区部分规模化鸡场ChPV流行病学调查和序列分析，为广西地区有效防控该病提供了科学依据。

关键词：鸡细小病毒流行病学调查广西规模化鸡场

罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2024年第2期 119-128页

作者：农源杨洋滕婷陈林孙彤彤郑喜邦李恭贺杨磊韦仁吴文德广西大学动物科学技术学院南宁530004 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室南宁530004

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非... 详细信息

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA方法并对该方法进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明:纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%~5.272%,批间变异系数为2.793%~5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳性血清和罗非鱼ScpB蛋白免疫血清,无法检测出罗非鱼嗜水气单胞菌阳性血清、罗非鱼荧光假单胞菌阳性血清、罗非鱼海豚链球菌阳性血清和罗非鱼鳗弧菌阳性血清;待测血清最大稀释度为1∶640;与无乳链球菌全菌包被ELISA检测方法比较,阳性率略低,符合率为83.43%。说明本研究建立的罗非鱼源无乳链球菌IgM抗体间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性。

关键词：无乳链球菌 ScpB 罗非鱼 IgM ELISA

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猫上呼吸道疾病的病原、诊断与防治

畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2345-2356页

作者：孙凡媛刘怡婷郭昕怡陈建材周华波覃一峰欧阳康韦祖樟黄伟坚陈樱无广西大学动物科学技术学院南宁530004 南宁市华波宠物医院南宁530004 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室南宁530004

猫上呼吸道疾病(feline upper respiratory tract disease, FURTD)是一种在猫中广泛传播的以上呼吸道、口腔和眼部症状为主的疾病。引起FURTD的病原多样,除常见的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫疱疹病毒Ⅰ型(feline herpesvir... 详细信息

猫上呼吸道疾病(feline upper respiratory tract disease, FURTD)是一种在猫中广泛传播的以上呼吸道、口腔和眼部症状为主的疾病。引起FURTD的病原多样,除常见的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫疱疹病毒Ⅰ型(feline herpesvirus type 1,FHV-1)、猫衣原体(Chlamydia felis,C.felis)、猫支原体(Mycoplasma felis,M.felis)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)外,临床中还有许多其他的病原偶见感染。临床中常出现由多种病原体混合感染的情况,并且病原的不断进化容易造成致病性的增强和组织嗜性的改变,这种病因的复杂性往往使得FURTD的防治较为困难。同时,由于许多病原感染引起猫的症状相似,仅凭临床症状无法准确判断出病因,准确认识不同病原的特性、掌握不同的病原检测方法对FURTD的病因快速诊断和提出高效的治疗方案至关重要。目前,不同病原引起的FURTD病例常被报道,而针对FURTD的诊断方法、治疗以及疫苗研制都尚未成熟,本文将对该疾病的常见和新发病原、诊断方法、治疗手段和防控措施进行系统地阐述,旨在为FURTD的防治工作提供更多的思路。

关键词：猫上呼吸道疾病病原混合感染诊断方法

猪流行性腹泻病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制和应用

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畜牧与兽医 2024年第4期56卷 95-100页

作者：陈芷珊陈滢锴陈中婷蒙淑玲江明生陈海兰广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530004

为了建立一种快速、高效且灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的现场快速检测技术,本研究以荧光量子点标记鼠抗PEDV单克隆抗体并喷涂到结合垫上,将鼠抗PEDV单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定到NC膜上,分别作为检测线和质控线制备荧光免疫... 详细信息

为了建立一种快速、高效且灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的现场快速检测技术,本研究以荧光量子点标记鼠抗PEDV单克隆抗体并喷涂到结合垫上,将鼠抗PEDV单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定到NC膜上,分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条,并对其敏感性、特异性及临床样品检测性能进行考察。结果:所制备的荧光试纸条可在20 min内完成临床样品中PEDV的现场检测,最低检测限为3.3×103 TCID50/mL,与猪轮状病毒、猪丁型冠状病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌等常见病原无交叉反应,对50份粪便、粪便拭子和肠道组织等临床样品进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为84.0%。本试验表明该试纸条具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测时间短,操作简便,可用于PEDV的现场快速筛查。

关键词：荧光免疫层析量子点猪流行性腹泻病毒快速检测

长白猪METTL3基因克隆及其在卵母细胞中的表达规律

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中国畜牧杂志 2024年

作者：李思佳郑彦梓王燕新贾茹茹王云李政达甘露石德顺陆凤花广西大学动物科学技术学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西大学动物科学技术学院广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室钦州市动物疫病预防控制中心

甲基转移酶样3（METTL3）是一种重要的甲基化酶，在调控细胞功能和命运方面发挥着关键作用。本试验旨在探究长白猪METTL3基因编码蛋白的生物学特性，及其在卵母细胞体外成熟前后和早期胚胎发育各时期的表达模式。试验采用PCR方法扩增、... 详细信息

甲基转移酶样3（METTL3）是一种重要的甲基化酶，在调控细胞功能和命运方面发挥着关键作用。本试验旨在探究长白猪METTL3基因编码蛋白的生物学特性，及其在卵母细胞体外成熟前后和早期胚胎发育各时期的表达模式。试验采用PCR方法扩增、克隆长白猪METTL3基因的目的片段，并进行生物信息学分析。结果表明，长白猪METTL3基因CDS序列全长为1 743 bp，共编码580个氨基酸。长白猪METTL3基因氨基酸序列与家犬、牛、斑马鱼、人、山羊、绵羊等11个物种进行同源性比对，与绵羊的同源性最高（95.59%），与斑马鱼的同源性最低（68%）。长白猪METTL3蛋白二级结构主要由α-螺旋（33.45%）、无规则卷曲（50.34%）、延伸链（12.41%）和β-转角（3.79%）构成，存在59个磷酸化位点，并且无信号肽结构。RT-qPCR结果表明，METTL3在长白猪卵母细胞体外成熟前后和孤雌激活后的胚胎发育各时期均有表达，其中在囊胚时期的表达量最高，在生发泡期（GV）表达量最低。本研究克隆得到了长白猪METTL3基因，并揭示了其在长白猪卵母细胞体外成熟前后和早期胚胎发育各时期的表达模式，为阐明METTL3在长白猪卵母细胞和早期胚胎发育中的作用奠定了基础。

关键词：长白猪 METTL3 卵母细胞体外成熟基因克隆