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基因工程改造促进大肠杆菌发酵纤维素水解液合成1,2,4-丁三醇

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化工进展 2024年第2期43卷 1063-1068页

作者：佘丹王舒婷陆信曜宗红诸葛斌江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室工业微生物研究中心江苏无锡214122

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达... 详细信息

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达四种糠醛耐受相关的基因:yghA、thyA、mdtJI和pntAB。在0.4g/L糠醛压力下,所有改造菌株的生长均有不同程度的提升,其中过表达pntAB基因的菌株生长最好,同时有助于BT合成酶的酶活力或转录水平的提高,BT产量达到11.0g/L。当以玉米芯纤维素水解液为底物时,过表达yghA、thyA和pntAB均明显促进了大肠杆菌的生长与BT产量的提高,其中yghA基因表现最好,在摇瓶中获得了3.36g/L的BT,在5L发酵罐中BT产量达到15.3g/L,转化率为63.8%。该策略为玉米芯纤维素水解液发酵生产BT提供了借鉴。

关键词：大肠杆菌玉米芯纤维素水解液糠醛耐受 1 2 4-丁三醇

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恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇

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食品与发酵工业 2024年第2期50卷 34-40页

作者：底心怡刘春立刘秀霞杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠... 详细信息

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。

关键词：紫苏醇细胞色素P450 CymAab 恶臭假单胞菌广宿主载体萜类化合物耐受度

烟酰胺核糖激酶在大肠杆菌中的高效异源表达、酶学特性分析和发酵工艺探究

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食品与发酵工业 2024年

作者：毛歆安龚劲松苏畅李恒徐国强许正宏史劲松江南大学生命科学与健康工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心四川大学轻工科学与工程学院

烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase，Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide，β-NMN)，是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选，实现Nrk在大肠杆菌中的... 详细信息

烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase，Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide，β-NMN)，是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选，实现Nrk在大肠杆菌中的可溶表达，初始酶活力为2.14 U/mL。通过核糖体结合位点序列(ribosome binding site，RBS)和启动子优化，将翻译起始速率为35 000 a.u.的RBS序列与双启动子PalsR-T7组合，构建的重组菌酶活力可达5.56 U/mL，是初始水平的2.6倍。Nrk酶学性质研究表明，该酶的最适反应条件为50 ℃，pH 7.0，10 mmol/L Mg2+。最后，对产Nrk重组菌进行培养条件优化，并在5 L发酵罐中进行罐上产酶放大工艺研究，最终使得酶活力达到72.33 U/mL，是摇瓶发酵水平的13倍。该研究显著提升了Nrk在大肠杆菌中的异源表达水平，为β-NMN的生物酶法合成奠定了基础。

关键词：烟酰胺核糖激酶 β-烟酰胺单核苷酸核糖体结合位点启动子工程异源表达

基于组学分析优化兽疫链球菌的透明质酸发酵生产

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食品与发酵工业 2024年第4期50卷 10-16页

作者：胡云箫吴俊俊赵北辰王阳康振糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 食品合成生物技术教育部工程研究中心江南大学未来食品科学中心江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。该研究首先... 详细信息

透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。该研究首先对兽疫链球菌WSH-24的全基因组和转录组数据进行了测序分析,发现该菌株具有高效的糖酵解和乳酸合成能力,以及不完整的三羧酸循环和多种氨基酸合成途径的缺失。结合生长曲线分析,进一步明确该菌株为缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸4种氨基酸缺陷型。在此基础上,通过外源添加对应的氨基酸使透明质酸产量达到(2.65±0.02)g/L。其次,结合转录组测序数据,确定了维生素B5、维生素B7和维生素B12相关合成基因的转录水平过低。通过外源添加对应的维生素有效提高透明质酸的合成,使其产量达到(2.46±0.07)g/L。最后,通过培养基优化,在3 L发酵罐上透明质酸发酵质量浓度达到5.63 g/L,生产强度为0.31 g/(L·h),相较优化前提高了33.33%。该研究为进一步改造兽疫链球菌WSH-24奠定了基础,为透明质酸的产量提升提供了支撑。

关键词：透明质酸兽疫链球菌全基因组转录组发酵优化

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三种单萜对皿式培养樟芝三萜合成的影响

食品与发酵工业 2024年第9期50卷 78-83页

作者：李心阳罗志珊耿燕任怡琳许泓瑜史劲松陆震鸣许正宏江南大学工业生物技术教育部重点实验室生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122

三萜是药食用真菌樟芝野生子实体中主要的活性成分之一,但是人工皿式培养的樟芝菌丝体中三萜含量较低。为了提高樟芝皿式培养三萜的产量,该研究在培养基中添加了3种单萜作为刺激因子。通过添加浓度的优化,得到了对生物量具有显著促进作... 详细信息

三萜是药食用真菌樟芝野生子实体中主要的活性成分之一,但是人工皿式培养的樟芝菌丝体中三萜含量较低。为了提高樟芝皿式培养三萜的产量,该研究在培养基中添加了3种单萜作为刺激因子。通过添加浓度的优化,得到了对生物量具有显著促进作用的添加方式是0.08 g/L的α-松油醇;对三萜产率具有显著促进作用的最佳添加方式为0.16 g/L的松油烯、0.08 g/L的α-松油醇以及0.12 g/L的4-萜烯醇,三萜产率分别较对照组提高了55.68%、50.39%和28.56%;且在添加0.16 g/L的松油烯时,有两种三萜(去氢硫色多孔菌酸和去氢齿孔菌酸)在樟芝菌丝体中的含量显著升高,分别较对照组提高了5.56倍和0.96倍,在添加0.08 g/L的α-松油醇时,去氢硫色多孔菌酸的含量显著升高,较对照组提高了3.20倍。该研究发现了3种可以促进樟芝皿式培养三萜生成的单萜,为樟芝皿式培养提供了新的思路。

关键词：樟芝三萜皿式培养 α-松油醇松油烯 4-萜烯醇去氢硫色多孔菌酸去氢齿孔菌酸

原儿茶酸脱羧关键酶挖掘改造优化儿茶酚生物合成

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生物工程学报 2024年第9期40卷 3057-3071页

作者：田立岩李静江小龙宋国田路福平戴宗杰李庆刚王钦宏天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308

儿茶酚(catechol,CA)是一种重要的化工和医药中间体,应用范围极为广泛。目前制备CA的方法是苯酚羟化法,但由于该方法存在对环境污染大、石化资源不可再生等问题,使得生物合成儿茶酚的方法逐渐受到关注。但受制于原儿茶酸脱羧酶的活性不... 详细信息

儿茶酚(catechol,CA)是一种重要的化工和医药中间体,应用范围极为广泛。目前制备CA的方法是苯酚羟化法,但由于该方法存在对环境污染大、石化资源不可再生等问题,使得生物合成儿茶酚的方法逐渐受到关注。但受制于原儿茶酸脱羧酶的活性不够高且生物合成儿茶酚生产效率较低,难以满足大规模工业生产的要求。为了进一步提高儿茶酚生产效率,本研究首先对不同来源的21个原儿茶酸(protocatechuic acid,PCA)脱羧酶进行筛选,发现理研菌(Rikenellaceae)来源的RbAroY脱羧酶性能最好,含有该酶的全细胞生物催化剂ER11能够合成13.54 g/L儿茶酚。然后利用在线工具HotSpotWizard对该酶进行稳定性计算,选取自由能下降最多的10个潜在突变位点进行验证,发现含有突变子RbAroYG99A的全细胞生物催化剂ERT01能够催化合成15.16 g/L儿茶酚,较野生型产量提高12%。之后对生物催化条件进一步优化,以原儿茶酸为底物,全细胞生物催化剂ERT01能够催化合成25.70 g/L儿茶酚。最后,以3-脱氢莽草酸发酵液为底物,同时表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸脱羧酶的全细胞生物催化剂DER03,催化合成29.55 g/L儿茶酚,为目前国内外报道的生物合成的最高产量。本研究为儿茶酚生物合成工业生产提供了重要参考。

关键词：生物合成全细胞催化原儿茶酸脱羧酶儿茶酚

水力空化处理对大豆分离蛋白与儿茶素相互作用及结构功能特性的影响

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食品科学 2024年第7期45卷 202-210页

作者：谢欢欢任仙娥宋杨凤杨锋广西科技大学生物与化学工程学院广西糖资源绿色加工重点实验室广西高校糖资源加工重点实验室广西柳州螺蛳粉工程技术研究中心广西柳州545006

采用基于孔板的水力空化对儿茶素与大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)的混合物进行处理,通过比较处理前后儿茶素与SPI的结合量,以及所形成复合物的紫外吸收光谱、荧光光谱、游离巯基与游离氨基含量、表面疏水性、平均粒径与Zeta电... 详细信息

采用基于孔板的水力空化对儿茶素与大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)的混合物进行处理,通过比较处理前后儿茶素与SPI的结合量,以及所形成复合物的紫外吸收光谱、荧光光谱、游离巯基与游离氨基含量、表面疏水性、平均粒径与Zeta电位、二级结构、抗氧化活性等的变化,研究水力空化处理对儿茶素与SPI相互作用及所形成复合物的结构功能特性的影响。结果表明:水力空化处理能促进儿茶素与SPI的相互作用,在儿茶素添加量为2.0 mg/mL时,水力空化处理能将儿茶素与SPI的结合量由(21.82±0.18)mg/g提高至(62.55±0.36)mg/g;与未处理的复合物相比,水力空化处理后SPI-儿茶素复合物的紫外吸收增强,荧光强度减弱,平均粒径增大,Zeta电位绝对值、表面疏水性、游离巯基和游离氨基含量下降,二级结构中α-螺旋、β-转角和无规卷曲相对含量增加,β-折叠相对含量减小;另外,经水力空化处理后复合物的抗氧化活性明显增强,在儿茶素添加量为2.0 mg/mL时,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率由处理前的(48.64±1.24)%上升至(84.72±0.12)%,2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除率由(35.60±1.21)%上升至(75.51±0.79)%,铁离子还原能力由0.81±0.02上升至1.52±0.05。可见,水力空化处理能够促进儿茶素与SPI的结合,改变复合物的结构性质,增强复合物的抗氧化活性。

关键词：水力空化大豆分离蛋白儿茶素相互作用抗氧化活性

酱香型白酒第2、3轮次堆积发酵有机酸代谢规律与菌群结构及其相关性解析

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食品科学 2024年第18期45卷 106-115页

作者：黄廷财柴丽娟时伟吴双全杨波张晓娟陆震鸣王松涛沈才洪许正宏江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 贵州中鉴酒业集团有限公司贵州遵义563000 国家固态酿造工程技术研究中心四川泸州646000

本实验以酱香型白酒优势产酒轮次(即第3、4轮次基酒所对应的第2、3轮次)堆积发酵过程中的酒醅为研究对象,采用高效液相色谱和高通量测序等技术对酒醅中的有机酸及菌群结构进行分析,探讨堆积发酵过程中有机酸与微生物群落之间的互作关系... 详细信息

本实验以酱香型白酒优势产酒轮次(即第3、4轮次基酒所对应的第2、3轮次)堆积发酵过程中的酒醅为研究对象,采用高效液相色谱和高通量测序等技术对酒醅中的有机酸及菌群结构进行分析,探讨堆积发酵过程中有机酸与微生物群落之间的互作关系。结果表明,堆积发酵酒醅中主要有机酸为乳酸(32.70 mg/g,醅样内平均含量,后同)、乙酸(4.87 mg/g)和琥珀酸(1.93 mg/g)。第2、3轮次堆积发酵酒醅中共有8个优势细菌属和7个优势真菌属(平均相对丰度>1%),细菌的优势菌属主要为枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)和芽孢杆菌属(Bacillus);真菌的优势菌属主要为红曲霉属(Monascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。主坐标分析表明,第2、3轮次堆积发酵细菌群落结构存在显著差异,真菌差异不显著。共现性网络分析表明,细菌-真菌(55.60%)、细菌-细菌(50.57%)和真菌-真菌(91.67%)网络均以正相关为主,且细菌-细菌群落之间存在更多的未知互作关系。Mantel test分析表明,酸度与细菌群落结构呈极显著正相关(P研究结果可为优质酱酒的生产调控提供一些理论基础。

关键词：酱香型白酒堆积发酵微生物群落结构有机酸

四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

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食品与发酵工业 2024年第3期50卷 9-15,I0001页

作者：邹潇毅王世杰杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),... 详细信息

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

关键词：毕赤酵母甲醇利用途径同化同工酶区室化木酮糖-5-磷酸