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中国畜牧兽医 2024年第5期51卷 2081-2090页

作者：万丽军王盛谢芝勋任红玉谢丽基范晴罗思思李孟张艳芳曾婷婷黄娇玲张民秀谢志勤李小凤韦悠广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室南宁530001

【目的】了解鸡肝癌细胞(LMH)感染血清4型禽腺病毒(FAdV-4)后干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达量变化,为研究FAdV-4与ISGs的相互作用提供参考依据。【方法】试验将FAdV-4感染LMH细胞,观察不同时间点细胞病变,并收集感染0、12、2... 详细信息

【目的】了解鸡肝癌细胞(LMH)感染血清4型禽腺病毒(FAdV-4)后干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)的表达量变化,为研究FAdV-4与ISGs的相互作用提供参考依据。【方法】试验将FAdV-4感染LMH细胞,观察不同时间点细胞病变,并收集感染0、12、24、36、48、60、72、84和96 h的细胞样品,通过实时荧光定量PCR技术检测感染病毒后不同时间点IFN-α和IFN-β及ISGs基因在转录水平上表达量的动态变化规律。【结果】LMH细胞感染FAdV-448 h时出现典型的细胞病变;在感染12 h后,FAdV-4快速增殖,60 h时达到峰值;感染病毒后各时间点,与对照组相比,IFN-α基因转录水平表达量均显著下调(P所下降且趋于稳定,但仍显著高于对照组(P所下降,但仍显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,CD 47、OAS和PKR基因均呈现下调表达。【结论】在FAdV-4感染LMH细胞后,IFN及多种ISGs在转录水平呈现规律性变化,与病毒在LMH细胞中复制存在一定的联系,表明这些天然免疫因子可能在抗FAdV-4反应中发挥着重要作用。

关键词：血清4型禽腺病毒(FAdV-4) LMH细胞干扰素干扰素刺激基因转录

禽呼肠孤病毒σA蛋白单克隆抗体的制备及夹心ELISA检测方法的建立

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中国兽医学报 2024年

作者：杨冰怡谢芝勋谢志勤任红玉韦悠谢丽基黄娇玲王盛广西大学动物科学技术学院广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室

旨在制备禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白单克隆抗体及建立一种夹心ELISA方法检测ARV病原。以原核表达ARVσA蛋白作为抗原，免疫BALB/ c小鼠，筛选稳定的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，建立基于单克隆抗体的σA -夹心ELISA检测方法，并进行敏... 详细信息

旨在制备禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白单克隆抗体及建立一种夹心ELISA方法检测ARV病原。以原核表达ARVσA蛋白作为抗原，免疫BALB/ c小鼠，筛选稳定的杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，建立基于单克隆抗体的σA -夹心ELISA检测方法，并进行敏感性、特异性、重复性和准确性检验。结果显示，成功构建了重组质粒pET-32a-σA，并在大肠杆菌中良好表达。通过杂交瘤细胞筛选，获得了2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为6B3和8E11，2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能与天然ARV反应。选择其中1株6B3分泌的单克隆抗体作为捕获抗体，ARV阳性鸡多克隆抗体作为检测抗体，通过优化反应条件，建立了检测ARV的σA -夹心ELISA方法。特异性检测显示该法只检出ARV病原，没有检出其他常见鸡病病原；敏感性试验显示其能检出7.72×102EID50/mL的ARV；重复性试验显示批内和批间试验的变异系数(Cv)均小于5.0%，重复性好。用σA -夹心ELISA方法与PCR方法同时对30份样品进行检测，两者检测结果相符。结果表明成功建立基于ARV σA蛋白单克隆抗体的夹心ELISA方法用于ARV的鉴别检测，为准确快速检测ARV提供技术手段。

关键词：禽呼肠孤病毒 σA蛋白单克隆抗体夹心ELISA

H9N2亚型AIV NP蛋白原核表达及其免疫效果

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中国兽医学报 2024年

作者：李小凤谢芝勋阮志华李孟李丹张民秀谢志勤罗思思韦悠谢丽基曾婷婷张艳芳黄娇玲王盛广西壮族自治区兽医研究所农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西兽医生物技术重点实验室

旨在探讨H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) NP蛋白对小鼠的免疫效果,为研制禽流感病毒(AIV)疫苗奠定基础。试验将H9N2病毒NP基因扩增产物连接到pET-32a表达载体中,构建重组质粒pET-32aNP,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,IPTG... 详细信息

旨在探讨H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) NP蛋白对小鼠的免疫效果,为研制禽流感病毒(AIV)疫苗奠定基础。试验将H9N2病毒NP基因扩增产物连接到pET-32a表达载体中,构建重组质粒pET-32aNP,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达,NP重组蛋白免疫小鼠,测定小鼠血清中IgG抗体,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示:NP基因编码区序列全长1 497 bP,NP重组蛋白以可溶性和不可溶性蛋白两种形式存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫小鼠后血清产生IgG结合抗体,抗体效价为1:40 000,IL-2、IL-5、IL-13分泌量分别与对照组的相比,极显著提高(P0.05)。结果表明,NP重组蛋白是一种良好的免疫原,为流感疫苗深入研究奠定基础。

关键词： H9N2亚型禽流感 NP蛋白原核表达细胞因子

H9N2亚型AIV NP蛋白的原核表达及其免疫效果

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中国兽医学报 2024年第6期 1113-1119页

作者：李小凤谢芝勋阮志华李孟李丹张民秀谢志勤罗思思韦悠谢丽基曾婷婷张艳芳黄娇玲王盛广西壮族自治区兽医研究所农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室/广西兽医生物技术重点实验室

旨在探讨H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)NP蛋白对小鼠的免疫效果，为研制AIV疫苗奠定基础。试验将H9N2亚型病毒NP基因的扩增产物连接到pET-32a表达载体中，构建重组质粒pET-32a-NP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，IPT... 详细信息

旨在探讨H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)NP蛋白对小鼠的免疫效果，为研制AIV疫苗奠定基础。试验将H9N2亚型病毒NP基因的扩增产物连接到pET-32a表达载体中，构建重组质粒pET-32a-NP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，IPTG诱导后，通过SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达，用NP重组蛋白免疫小鼠，测定小鼠血清中IgG抗体和脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示：NP基因编码区序列全长1 497 bp, NP重组蛋白以可溶性和不可溶性蛋白两种形式存在，Western blot结果可见特异性条带。免疫小鼠后血清产生IgG结合抗体，抗体效价为1∶40 000,与对照组相比，IL-2、IL-5、IL-13分泌量极显著提高(P0.05)。结果表明，NP重组蛋白是一种良好的免疫原，为流感疫苗的深入研究奠定了基础。

关键词： H9N2亚型禽流感 NP蛋白原核表达细胞因子

通过抑制caspase-8活性提高PRRSV体外培养滴度的初步研究

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 27-34页

作者：钟华刘金凤陈冰覃绍敏陈凤莲马玲林俊毛燕秦树英白安斌广西民族大学海洋与生物技术学院南宁530006 广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室南宁530001

探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制,从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞,并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHDFMK)分别处理PRRSV感染细... 详细信息

探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制,从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞,并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHDFMK)分别处理PRRSV感染细胞,通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID50)来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示:z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂,10μmol/L为最佳使用浓度,PRRSV感染细胞48 h后加入10μmol/L Z-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外,PRRSV感染Marc-145细胞后,细胞caspase-8活性显著增加,且随着感染时间的延长,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势,而抑凋亡因子Bcl-2表达水平却呈下降趋势;用抑制剂z-IETD-FMK处理后,细胞caspases-8活性下调,细胞凋亡率也下降,Bax表达量显著低于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01),与此相反Bcl-2的表达水平为升高趋势,显著高于不加抑制处理的病毒感染组(P<0.01)。说明,caspase-8特异性抑制剂能有效抑制PRRSV诱导的细胞凋亡。结果提示HPPRRSV感染可通过caspase-8途径诱导Marc-145细胞凋亡,从而抑制病毒的复制。使用caspase-8特异性抑制剂可有效抑制细胞凋亡,进而提高病毒体外培养滴度。

关键词： HP-PRRSV caspase 细胞凋亡活性检测

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mRNA疫苗制备技术在甲型流感病毒疫苗研究中的应用

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黑龙江畜牧兽医 2024年第12期 16-22,28页

作者：张民秀谢芝勋李孟罗思思谢丽基谢志勤李丹阮志华王粲广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室南宁530001

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H1N1和H3N2亚型人流感病毒(Influenza virus,IV)均属于甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)。IAV含有多种亚型,毒株变异快,因此IAV疫苗株需要根据当年的优势毒株进行相应的调整,这给疫苗的研... 详细信息

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H1N1和H3N2亚型人流感病毒(Influenza virus,IV)均属于甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)。IAV含有多种亚型,毒株变异快,因此IAV疫苗株需要根据当年的优势毒株进行相应的调整,这给疫苗的研制和生产带来巨大挑战。信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)疫苗制备工艺简单、生产时间短且容易规模化生产,在疾病预防方面具有广阔的应用前景。笔者对mRNA疫苗的种类、优化策略和IAV mRNA疫苗的研究现状进行了综述,旨在为IAV mRNA疫苗的研发提供理论参考。

关键词：甲型流感病毒(IAV) 禽流感病毒(AIV) 信使核糖核酸(mRNA) 非复制型mRNA(Nr mRNA) 自我扩增型mRNA(Sa mRNA) 疫苗

H9亚型禽流感病毒M1蛋白原核表达及免疫效果初步研究

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动物医学进展 2024年第6期45卷 1-6页

作者：李小凤谢芝勋阮志华李孟李丹张民秀谢志勤罗思思韦悠谢丽基曾婷婷张艳芳黄娇玲王盛广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞... 详细信息

旨在原核表达H9亚型禽流感病毒(AIV)M1蛋白,初步探究其免疫效果,为研制AIV疫苗奠定基础。通过构建重组质粒pET-32a-M1,诱导表达,Western blot验证蛋白表达情况,将重组蛋白免疫接种小鼠,通过测定血清中IgG抗体效价,脾细胞培养上清多细胞因子分泌情况评价其免疫效果。结果显示,M1重组蛋白主要以可溶性蛋白存在,Western blot结果可见特异性条带。免疫接种小鼠后,血清产生IgG抗体,抗体效价为1∶30000。小鼠脾细胞上清液IL-2、IL-4、IL-6与对照组相比较,含量显著增加(P研究奠定了基础。

关键词：禽流感 M1蛋白原核表达免疫效果

鸡圆圈病毒3型可视化LAMP检测方法的建立及应用

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河南农业科学 2024年第4期53卷 128-136页

作者：张民秀谢芝勋张艳芳谢志勤谢丽基李孟罗思思曾婷婷王粲广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)—东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001

建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方... 详细信息

建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。

关键词：鸡圆圈病毒3型(GyV3) 可视化LAMP 特异性引物诊断方法敏感性

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一种新型电化学免疫传感器检测血清4型禽腺病毒

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 249-257页

作者：黄娇玲谢芝勋罗思思李孟谢丽基邓显文谢志勤曾婷婷张艳芳范晴张民秀王盛李丹韦悠李小凤广西壮族自治区兽医研究所农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室/广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

将多壁碳纳米管-壳聚糖-铂纳米粒子复合材料(MWCNT-Chi-PtNP)修饰金电极(GE),并吸附血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)蛋白单克隆抗体(MAb/FAdV-4),构建一种新型的电阻型电化学免疫传感器用于检测FAdV-4。对传感器的... 详细信息

将多壁碳纳米管-壳聚糖-铂纳米粒子复合材料(MWCNT-Chi-PtNP)修饰金电极(GE),并吸附血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)蛋白单克隆抗体(MAb/FAdV-4),构建一种新型的电阻型电化学免疫传感器用于检测FAdV-4。对传感器的测试底液及样品孵育时间进行优化后,在最优条件下,对所构建的传感器的敏感性、特异性和稳定性进行检测。并对36份临床样品进行检测,以验证该传感器的实用性。结果显示,所建立的FAdV-4电化学免疫传感器的测试底液最佳pH值为7.0,样品的最佳孵育时间为30 min,检测线性范围10^(1.46)~10^(4.46)EID50/mL FAdV-4,最低检出限为10^(1.89)EID50/mL FAdV-4(S/N=3);敏感性试验结果显示该免疫传感器灵敏度比常规PCR方法(10^(3.46)EID50/mL)FAdV-4高37倍,且该传感器特异性高,稳定性好;该传感器对36份临床样品进行检测,结果与PCR方法和测序结果相符。结果表明,所建立的FAdV-4电化学免疫传感器具有检测快速、特异性好和敏感性高等优点,为FAdV-4的诊断提供一种新型的快速检测技术。

关键词：多壁碳纳米管电化学免疫传感器铂纳米粒子血清4型禽腺病毒