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我国主要传疟按蚊及其杀虫剂抗性基因高通量双端标签序列检测方法的建立

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中国热带医学 2024年第3期24卷 287-294页

作者：曹自有戴雨琪尹建海夏志贵中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 世界卫生组织热带病合作中心科技部国家级热带病国际联合研究中心国家卫生健康委寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

目的建立一种可同时、快速、准确检测我国主要传疟按蚊蚊种及其抗性基因的高通量方法,为疟疾消除后我国主要传疟媒介监测提供高通量监测工具。方法2022年8月—2023年7月在云南腾冲市、海南省文昌市、辽宁省东港市不同采样点采集中华按... 详细信息

目的建立一种可同时、快速、准确检测我国主要传疟按蚊蚊种及其抗性基因的高通量方法,为疟疾消除后我国主要传疟媒介监测提供高通量监测工具。方法2022年8月—2023年7月在云南腾冲市、海南省文昌市、辽宁省东港市不同采样点采集中华按蚊、微小按蚊、大劣按蚊和嗜人按蚊成蚊。采用聚合酶链式反应(polymerase chain re‐action,PCR)技术和Sanger测序分别检测按蚊ITS2、kdr(L1014)、rdl(A296)及ace-1(G119)基因;使用优化的多重PCR反应体系、定制设计双端标签序列(barcode)引物和下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)检测混合样本的上述基因。采用Kappa一致性检验和多个率比较的卡方检验评价方法的一致性,采用四格表计算方法的灵敏度、特异度以及约登指数,对每种方法正常操作流程下各个环节涉及的费用进行统计汇总,并综合确定最适混合检测样本量。结果常规PCR扩增300只蚊虫基因组DNA,扩增产物Sanger测序结果分别为144只中华按蚊、53只大劣按蚊、62只嗜人按蚊和41只微小按蚊,抗性基因kdr(L1014)、rdl(A296)和ace-1(G119)突变数量分别为73只、27只和41只。应用新建立的基于定制双端barcode的多重PCR反应体系和NGS测序技术,检测不同样本量下Sanger测序对应的样本,2种方法检测结果的一致性高(全部Kappa>0.900),多重比较显示样本量N(40、80、160)、N(120、200、240、280)和N(300)三者之间2种方法检测一致率差异有统计学意义(χ^(2)=26.547,P0.994(120)>0.990(280)>0.988(200)>0.987(240)>0.985(300)。从检测40到300个样本量,新建方法单个测序位点费用从20.0元降低至8.3元,常规方法单个测序位点费用从16.7元降低至15.4元。新建方法的最佳检测混合样本量为280。结论新建立的多重PCR、双端barcode和NGS相结合检测方法可同时检测我国4种传疟按蚊蚊种和ace-1、kdr、rdl抗性基因突变位点情况,该方法稳定性好,灵敏度、特异度高,一次可检测较大样本量,相对于其他类型的检测方法成本经济性好。

关键词：疟疾按蚊抗性基因多重PCR技术双端标签序列标记高通量检测

全国2017—2022年输入性恶性疟流行病学特征分析

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中国热带医学 2024年第4期24卷 388-393页

作者：易博禹夏志贵张丽中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织热带病合作中心国家级热带病国际联合研究中心上海200025

目的通过分析2017—2022年全国输入性恶性疟病例的流行病学特征,了解我国疟疾消除前后输入性恶性疟疫情变化趋势,为进一步做好境外输入性恶性疟防控工作提供数据支撑。方法收集整理寄生虫病防治信息管理系统中2017—2022年31个省(自治... 详细信息

目的通过分析2017—2022年全国输入性恶性疟病例的流行病学特征,了解我国疟疾消除前后输入性恶性疟疫情变化趋势,为进一步做好境外输入性恶性疟防控工作提供数据支撑。方法收集整理寄生虫病防治信息管理系统中2017—2022年31个省(自治区、直辖市)和新疆生产建设兵团(未包括台湾、香港和澳门地区)的恶性疟个案流行病学调查表,对疫情概况、境外感染地、三间分布等进行统计和分析。结果2017—2022年全国累计报告恶性疟7026例,占疟疾病例总数64.2%(7026/10943),均为境外输入性病例,感染地分布在4个洲60个国家,以非洲国家为主。2017—2022年每月均有恶性疟报告,各月分布不均,在年初出现高峰;输入性恶性疟病例数位居前5位的地区分别为广东省(13.1%,922/7026)、江苏省(9.1%,636/7026)、山东省(8.1%,569/7026)、广西壮族自治区(7.6%,537/7026)和浙江省(7.6%,534/7026);以中国籍病例为主(占94.9%,6668/7026),男女性别比为17.2∶1。在报告的恶性疟病例中,危重症病例239例、死亡病例48例。结论在防止疟疾输入再传播阶段,虽然我国报告疟疾病例均为境外输入性病例,但恶性疟占比较高,考虑其病情复杂且发展较快,容易导致危重症甚至死亡,因此要做到及时发现、准确诊断和规范治疗疟疾病例,减少危重症或死亡。

关键词：输入性恶性疟流行病学特征中国

基于CRISPR/Cas系统的生物传感器在动物疫病诊断中的应用

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畜牧兽医学报 2024年第7期55卷 2859-2876页

作者：陈秀琴林甦张世忠郑敏黄梅清福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013

动物疫病不仅严重危害动物健康,阻碍养殖业良性发展,而且对人类健康构成潜在威胁。开发灵敏、特异、快速的诊断方法对于疫病防控尤为重要。PCR是目前检测病原体核酸的金标准,但是它存在检测周期较长,需要精密仪器和专业技术人员,无法应... 详细信息

动物疫病不仅严重危害动物健康,阻碍养殖业良性发展,而且对人类健康构成潜在威胁。开发灵敏、特异、快速的诊断方法对于疫病防控尤为重要。PCR是目前检测病原体核酸的金标准,但是它存在检测周期较长,需要精密仪器和专业技术人员,无法应用于现场即时检测等局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)具有敏感性高、特异性强和操作简便等优点,可为动物疫病诊断提供新的方法和契机。CRISPR-Cas9靶向核酸的特异性和CRISPR-Cas12/Cas13“附属切割”活性使其在核酸检测中显示出巨大的应用前景。本文简述了CRISPR/Cas系统的分类,对3种常用的CRISPR/Cas系统的核酸检测策略进行系统阐述,并对其在动物疫病诊断中应用的最新研究进展进行综述,最后讨论了它的优势、面临的挑战及未来发展方向,以期为动物疫病诊断新方法的开发提供参考。

关键词： CRISPR/Cas 生物传感器动物疫病检测

呼出气挥发性有机物的采集及分析方法研究进展

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环境与职业医学 2024年第6期41卷 707-712页

作者：何雅珍高汭吴智君樊晶光丁春光广东药科大学公共卫生学院广东广州510224 国家卫生健康委职业安全卫生研究中心北京102308 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所北京102308

呼出气中挥发性有机物(VOCs)的组成和浓度与人体健康状态密切相关,通过采集人体呼出气分析VOCs已广泛应用于疾病的监测研究中。本文通过对呼出气VOCs的采集、富集和检测方法进行综述,为后续研究选择合适的技术提供参考。呼出气采集装置... 详细信息

呼出气中挥发性有机物(VOCs)的组成和浓度与人体健康状态密切相关,通过采集人体呼出气分析VOCs已广泛应用于疾病的监测研究中。本文通过对呼出气VOCs的采集、富集和检测方法进行综述,为后续研究选择合适的技术提供参考。呼出气采集装置主要有采集混合呼出气常用的采气袋和采集肺泡气常用的生物挥发性有机化合物呼吸(Bio-VOC)采样器。预富集设备包括热解吸仪或热脱附仪(TD)、固相微萃取装置(SPME)、针刺捕集装置(NTD)。呼出气VOCs的检测方法包括气相色谱质谱(GC-MS)、质子转移反应质谱(PTR-MS)、选择离子流管质谱法(SIFT-MS)、电子鼻等。目前呼出气的采集和富集技术尚未成熟,对呼出气检测结果的影响缺乏评估,未来应加强呼出气采集和富集技术的研究,进一步推动呼出气在疾病监测研究中的应用。

关键词：呼出气挥发性有机物采集富集检测

缘漏斗蛛(Agelena limbata)毒腺转录组学研究

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基因组学与应用生物学 2024年第5期43卷 817-827页

作者：杨梦慧张海珠刘衡杨志斌赵昱杨自忠大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室大理671003 大理大学药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心大理671003 大理大学药学与化学学院大理671003

为了探究蜘蛛毒素多样性,获取毒素基因序列,进一步研究蜘蛛毒液的成分与应用,本研究在对缘漏斗蛛(Agelena limbata)毒腺进行解剖后采用高通量测序技术对缘漏斗蛛毒腺进行转录组测序,并结合生物信息学方法对转录组进行分析。测序共获得43... 详细信息

为了探究蜘蛛毒素多样性,获取毒素基因序列,进一步研究蜘蛛毒液的成分与应用,本研究在对缘漏斗蛛(Agelena limbata)毒腺进行解剖后采用高通量测序技术对缘漏斗蛛毒腺进行转录组测序,并结合生物信息学方法对转录组进行分析。测序共获得43157个单基因(unigene),经NR(non⁃redundant protein sequence)数据库注释比对,与食母穹蛛(Stegodyphus du⁃micola)同源性最好。GO(the gene ontology resource)富集中蛋白复合物和免疫系统进程所占比例最多。KEGG(Kyoto encyclo⁃pedia of genes and genomes)数据库中与代谢相关的通路占比最高。Uniport数据库中比对的结果显示,毒腺中蛋白质的主要作用为抗菌、杀虫、阻断神经通路、阻断钠离子通道等。简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)位点中T/A、AT/TA与TG/CA出现的频率最高。通过单基因的功能注释,初步了解蜘蛛在捕食时毒腺的基因表达情况、基因主要行使的功能及参与的代谢途径,为了解蜘蛛捕食过程提供了基础。此外,根据序列同源性推断结果,发现缘漏斗蛛毒腺毒素中富含半胱氨酸毒素多肽及酶类,还有一些在生物医药领域也发挥重要作用的酶类,例如金属蛋白酶等。综上所述,缘漏斗蛛毒腺中含有丰富的毒素基因,本研究为后续的研究提供了转录组数据来源。

关键词：缘漏斗蛛(Agelena limbata) 毒腺高通量测序转录组学

响应面法优化梨黑斑病生防链霉菌SZF-179发酵培养基

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中国生物防治学报 2024年第4期40卷 936-947页

作者：刘芳权婷婷王开梅石丽桥温少华张菲杨晓平湖北省生物农药工程研究中心华中农业大学植物科技学院湖北省农业科学院果树茶叶研究所/果树种质创新与利用湖北省重点实验室

由链格孢引起的梨黑斑病是梨树生长及采后贮藏过程中的重要病害，其防治主要依赖于化学杀菌剂，亟需开发安全高效的生物杀菌剂。我们前期筛选获得的奥唐纳链霉菌Streptomyces odonnellii SZF-179菌株对梨黑斑病菌具有较强拮抗活性。为... 详细信息

由链格孢引起的梨黑斑病是梨树生长及采后贮藏过程中的重要病害，其防治主要依赖于化学杀菌剂，亟需开发安全高效的生物杀菌剂。我们前期筛选获得的奥唐纳链霉菌Streptomyces odonnellii SZF-179菌株对梨黑斑病菌具有较强拮抗活性。为提高其发酵水平，探究其在梨黑斑病生物防控中的应用潜力，采用响应面法对该菌株的发酵培养基进行了优化。通过单因素试验确定最佳摇瓶发酵条件、最适碳氮源与无机盐组合，Plackett-Burman试验筛选出影响菌株发酵上清液抑菌活性的3个显著因子：麦芽糖、酵母膏和碳酸钙；再结合最陡爬坡试验、Box-Behnken设计及响应面法拟合显著因子与菌株发酵上清液抑菌率的非线性方程求解，得到优化的发酵培养基配方，其组成为麦芽糖15.86 g/L、土豆淀粉10.00 g/L、酵母膏8.15 g/L、芝麻粕5.00 g/L、硫酸铵0.50 g/L和碳酸钙0.20 g/L。此模型预测发酵液上清液50倍稀释液抑菌率为70.39%，验证值为70.51%，预测值与验证值之间吻合较好，较优化前发酵液上清液50倍稀释液抑菌率（30.70%）提高了约1.3倍。优化后发酵培养物对梨黑斑病的田间防治效果达到61.21%，并使梨树的落叶率降至14.56%，显著低于对照的44.25%。本研究为新型绿色高效梨黑斑病生物杀菌剂产品的研制提供重要的技术支撑。

关键词：链霉菌梨黑斑病发酵培养基优化响应面法抑菌活性

大口黑鲈铜绿假单胞菌的分离鉴定与抗菌药物筛选

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江苏农业科学 2024年

作者：姚清潘创业姚伦广邱礽南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南省畜禽保健品工程技术研究中心河南省伏牛山昆虫生物学试验室和河南省昆虫生物反应器重点试验室

为了研究导致河南省某养殖场大口黑鲈皮肤溃烂并死亡的病因并从中分离优势感染菌株，从中获取大口黑鲈爆发该病的试验数据，达到预防与治疗的的目的。首先通过显微镜观察和分子生物学等手段排除寄生虫病和病毒感染的可能性，排除之后在... 详细信息

为了研究导致河南省某养殖场大口黑鲈皮肤溃烂并死亡的病因并从中分离优势感染菌株，从中获取大口黑鲈爆发该病的试验数据，达到预防与治疗的的目的。首先通过显微镜观察和分子生物学等手段排除寄生虫病和病毒感染的可能性，排除之后在患病大口黑鲈的肝脏和脾脏中，分离出1株优势菌株NY22101804，经过形态观察与通过生理生化试验分析和检测菌液16S rDNA基因序列并比对构建进化树分析，确认菌株类型，再通过人工回归感染试验验证致病性并通过纸片扩散法和牛津杯法测定了该菌对抗生素和中药单体的药物敏感性对药物进行筛选。结果显示该菌为铜绿假单胞菌株，同铜绿假单胞菌XZPG11株（HQ844508.1）的16SrRNA序列的同源性达到99.72%，通过人工回感试验发现，NY22101804对大口黑鲈具有急性致死效应，死亡率与浓度有依赖性呈正相关变化，通过药敏试验数据发现，菌液对妥布霉素、四环素等10种抗生素敏感，对青霉素、氨卡西林等9种抗生素具有耐药性，在中药单体的测试中，黄芩素表现出最好的抑菌效果，其他如黄芩苷、柚皮素、芦丁等也显示出不同程度的抑菌活性。

关键词：大口黑鲈铜绿假单胞菌药物敏感性 16S rRNA 中药单体

2021年8月珠海一起食源性疾病暴发事件中金黄色葡萄球菌病原学特征分析

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中国食品卫生杂志 2024年第6期36卷 735-740页

作者：方艳梅龙冬玲京舒娉陈晶京杨春晓黄辉涛黄利群黄开松珠海市疾病预防控制中心微生物检验所广东珠海519064 广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室广东东莞523822

目的研究一起食源性疾病事件金黄色葡萄球菌(金葡菌)病原学特征和同源性。方法采用国标方法分离鉴定病原菌,微量肉汤稀释法检测菌株对16种药物的敏感性,全基因组测序和生物信息学分析病原菌分子遗传特征和同源性。结果该事件分离得到16... 详细信息

目的研究一起食源性疾病事件金黄色葡萄球菌(金葡菌)病原学特征和同源性。方法采用国标方法分离鉴定病原菌,微量肉汤稀释法检测菌株对16种药物的敏感性,全基因组测序和生物信息学分析病原菌分子遗传特征和同源性。结果该事件分离得到16株金黄色葡萄球菌,包括8株患者分离株,1株厨工分离株和7株食品分离株。MLST和Spa分型结果为ST7-t91、ST5-t548、ST398-t588和ST965-t62,患者株分为ST7-t91型和ST5-t548型;ST7分离株均对四环素和青霉素耐药,携带耐药基因aadD、te(t K)、blaZ和lnu(A),ST5株对16种抗生素均敏感;cgMLST分析发现ST7型菌株间等位基因差异≤3;毒力基因注释发现ST7株携带sea、chp、scn和sak毒力基因,ST5株携带chp、scn、sak、seg、selk、selm、selo和seln毒力基因。结论该事件由多个ST型金葡菌混合感染引起,以ST7-t91型为主,该克隆株致病力强,但对头孢类抗生素和喹诺酮类等临床一线抗生素敏感。

关键词：食源性疾病金黄色葡萄球菌全基因组测序 cgMLST 肠毒素

2020－2023甘肃猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因遗传变异分析

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中国兽医科学 2024年

作者：焦守德张婧李平花王健韩庆彦张雨星魏达礼王方洲白兴文卢曾军马雪青孙普甘肃农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃省动物疫病预防控制中心

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 的流行及遗传变异情况，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对2020－2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序，通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传... 详细信息

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 的流行及遗传变异情况，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对2020－2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序，通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分析。结果显示，共检测了52份猪临床样品，PRRSV核酸阳性率为52%（32/52），成功获得了32条ORF5、15条NSP2和14条ORF3基因序列。ORF5基因遗传进化分析表明，2020－2023年甘肃地区猪群中PRRSV流行毒株中存在美洲型1.5谱系（4株）、1.8谱系（24株）、5.1谱系（2株）、8.7谱系（2株）；NSP2基因遗传进化分析表明，获得的15条NSP2序列均为1.8谱系；ORF3基因遗传进化分析表明，获得的14条ORF3序列包括1.5谱系（2株）、1.8谱系（11株）、3.5谱系（1株）。基因核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF5 82.3%～99.7%、NSP2 85.9%～90%和ORF3 89.8%～95.7%；基因编码氨基酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF5 79.6%～99%、NSP2 83.4%～87.7%和ORF3 85.1%～94.5%。ORF5基因编码的GP5蛋白的信号肽区、高变区、细胞表位区等区域均存在不同程度的变异，其中5株毒株的第33位氨基酸出现了缺失；15株NSP2蛋白氨基酸序列的缺失模式与NADC30株一致。上述结果表明，当前甘肃地区猪群中PRRSV呈现以1.8毒株谱系为优势的美洲型多谱系共循环流行，这对甘肃地区防控PRRSV提供了重要的流行病学数据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 NSP2 ORF3 遗传变异