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细胞嗜性差异的2株柯萨奇病毒A10型的构建与拯救

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中国生物制品学杂志 2022年第12期35卷 1437-1442页

作者：裴捷杨祥汪梦俊刘睿伦周金戈吕诗韵王文辉郭靖孟胜利申硕武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室国家联合疫苗工程技术研究中心湖北省疫苗技术创新中心湖北武汉430207

目的以Vero细胞及人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞嗜性差异的柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)2个毒株为模板,分别构建感染性克隆,并完成病毒拯救,为CV-A10毒株的细胞嗜性研究奠定基础。方法分别扩增Vero^(+)/RD+及Ve... 详细信息

目的以Vero细胞及人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞嗜性差异的柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)2个毒株为模板,分别构建感染性克隆,并完成病毒拯救,为CV-A10毒株的细胞嗜性研究奠定基础。方法分别扩增Vero^(+)/RD+及Vero^(-)/RD+细胞嗜性差异的CV-A10毒株基因组,在5′端引入T7启动子序列,3′端引入polyA尾及NotⅠ酶切位点。将扩增得到的基因组序列与线性化pBR322载体以无缝连接技术连接得到全长质粒,经线性化后分别与T7-RNA聚合酶表达质粒共转染RD细胞完成病毒拯救。通过病毒感染后细胞形态观察及间接免疫荧光试验,比较拯救毒株对Vero细胞嗜性的差异。结果成功构建了Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株2种感染性克隆,并在RD细胞内完成病毒拯救,序列测定结果表明拯救毒株与亲本毒株序列一致。拯救毒株rCV-A10-010195能够有效感染Vero细胞并形成典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),而rCV-A10-3482无法有效感染Vero细胞。结论建立了2株Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株反向遗传操作系统,为CV-A10毒株细胞嗜性的研究奠定了基础。

关键词： Vero细胞柯萨奇病毒A10型感染性cDNA 病毒拯救细胞嗜性

J亚群禽白血病病毒通过阻断IκB磷酸化抑制I型干扰素的产生

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J亚群禽白血病病毒通过阻断IκB磷酸化抑制I型干扰素的产生

中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学...

作者：许周懿严一铭李鸿鑫陈伟国陈峰蔺文成谢青梅华南农业大学广东省动物病毒载体疫苗工程技术研究中心广东省畜禽健康养殖与环境控制重点实验室

引言禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)/肉瘤病毒(ALSV)引起的鸡肿瘤性和免疫抑制性疾病,其中J亚群禽白血病对禽危害最严重。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)致病机制涉及多个方面,如细胞因子调节、促炎反应、细胞凋亡和适应性免疫反应答。本文...

引言禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)/肉瘤病毒(ALSV)引起的鸡肿瘤性和免疫抑制性疾病,其中J亚群禽白血病对禽危害最严重。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)致病机制涉及多个方面,如细胞因子调节、促炎反应、细胞凋亡和适应性免疫反应答。本文旨在揭示J亚群禽白血病诱导宿主免疫抑制的分子机制。材料与方法利用qRT-PCR和双荧光素酶报告基因等方法检测ALV-J感染前后HD11细胞和DF-1细胞中I型干

关键词：

来源： cnki会议评论

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不同层析介质纯化H5N1型流感病毒的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2023年第3期43卷 217-221页

作者：刘博张家友李芳张哲罡季雅琦周蓉李雪丹李泽李庆达吴文逸杨晓明武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室武汉430207 国家联合疫苗工程技术研究中心科研开发部武汉430075

目的分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液,并比较分离纯化效果。方法用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液,透射电镜分析不同样品中病毒... 详细信息

目的分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液,并比较分离纯化效果。方法用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液,透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态;分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion,SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein,HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA,HCD)含量,计算病毒抗原回收率和杂质去除率;用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性,并用t检验分析两种层析介质纯化效果差异。结果Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态;两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义(P>0.05),但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者,且差异有统计学意义(P动物实验表明两种层析介质纯化的病毒样品均具有良好的免疫原性。结论相对于Sepharose 4FF层析介质,Capto Core700在保证病毒抗原蛋白回收率的基础上可以更有效地去除HCP、HCD和总蛋白质等工艺相关杂质。本研究为MDCK细胞生产H5N1型流感病毒疫苗纯化工艺开发提供了参考。

关键词： H5N1型流感病毒分子筛层析介质 Capto Core700 复合型层析介质

1株人3型副流感病毒减毒活疫苗候选毒株在小鼠动物模型上的安全性、免疫原性及保护效力评价

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中国生物制品学杂志 2022年第11期35卷 1293-1305页

作者：关文竹火文李雄雄王云瑾王晓程亚慧寇桂英包红白慕群兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的评价1株人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type-3,HPIV-3)减毒活疫苗候选毒株CPW3在小鼠中的安全性、免疫原性及保护效力,以期为HPIV-3减毒活疫苗的研发提供候选毒株。方法从甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼... 详细信息

目的评价1株人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type-3,HPIV-3)减毒活疫苗候选毒株CPW3在小鼠中的安全性、免疫原性及保护效力,以期为HPIV-3减毒活疫苗的研发提供候选毒株。方法从甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物标本中分离培养HPIV-3,采用诱变剂加逐步降温法筛选具有冷适应(coldadaptation,Ca)及温度敏感(temperature sensitivity,Ts)特性的HPIV-3毒株CPW3。用CPW3经鼻腔免疫雌性BALB/c小鼠,免疫30 d内每天测定小鼠体质量和体温;噬斑减少试验测定小鼠血清中和抗体;qRT-PCR法检测小鼠肺部和鼻洗液中HPIV-3病毒载量;ELIspot法测定小鼠肺脏、脾脏和外周血中HPIV-3特异性IgG/IgA抗体分泌淋巴细胞(antibody secreting cells,ASC)应答;流式细胞术测定小鼠肺脏、脾脏和外周血中IFNγ-CD4+T/IFNγ-CD8+T/IL-4-CD4+T细胞应答。HPIV-3野毒株攻毒试验测定CPW3免疫对小鼠肺脏HPIV-3感染的保护效力。结果CPW3可在小鼠上、下呼吸道增殖,但在小鼠肺脏的病毒载量比其亲本株低约100倍;免疫后30 d内,CPW3对小鼠的体质量和体温无影响;体液免疫应答结果显示,CPW3不仅可诱导小鼠产生显著的血清中和抗体应答(t=7.296,P动物模型中,CPW3具有安全性和免疫原性,对小鼠HPIV-3感染具有显著的保护效力,是1株有前途的HPIV-3减毒活疫苗候选株。

关键词：人3型副流感病毒减毒活疫苗免疫原性保护效力

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恒河猴重复给药腺病毒载体疫苗毒性研究

毒理学杂志 2022年第5期36卷 377-384页

作者：戴锦龙黄远铿杨威周巧丽陈志森郭健敏广东莱恩医药研究院有限公司广东省药物非临床评价研究企业重点实验室国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心广东省创新药物评价与研究工程技术研究中心广东广州510990

目的探讨以5型腺病毒为载体的人用疫苗Ad5 SARS-CoV-2(LW2006)经3次皮下重复给予恒河猴所产生的毒性反应,为其安全性评价实验和临床用药提供基础数据。方法 30例恒河猴,雌雄各半,按体重均衡随机分为对照组(生理盐水)、LW2006低剂量(0.5... 详细信息

目的探讨以5型腺病毒为载体的人用疫苗Ad5 SARS-CoV-2(LW2006)经3次皮下重复给予恒河猴所产生的毒性反应,为其安全性评价实验和临床用药提供基础数据。方法 30例恒河猴,雌雄各半,按体重均衡随机分为对照组(生理盐水)、LW2006低剂量(0.5×10^(11)VP)组和LW2006高剂量(2.0×10^(11)VP)组。通过皮下注射连续给药3周,每周给药1次,恢复期观察4周。于给药结束、恢复观察结束后,分别剖检18只和12只恒河猴。检测观察指标包括临床观察、体重、血液、生化、尿常规、淋巴细胞亚群、细胞因子、抗核抗体、脏器重量、脏器系数和病理学检查。结果腺病毒疫苗可引起绝大部分动物给药部位皮肤皮下血管周围局灶性/多灶性炎细胞浸润。恢复期观察结束后,以上变化与给药结束后相比,皮下反应动物比例和程度均明显降低,其余检查脏器包括免疫器官胸腺、脾和淋巴结等均未见明显异常变化。结论在本实验条件下,以5型腺病毒为载体的人用疫苗Ad5 SARS-CoV-2可引起恒河猴给药部位皮下局部轻度刺激性反应,恢复期可逆,无其他毒理学反应。

关键词：腺病毒载体疫苗恒河猴重复给药安全性评价

I群禽腺病毒（4型）Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫效果研究

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中国动物传染病学报 2022年

作者：杜东颖盛东北霍环艳段佳蕾王孟月谭镜明陈宇明胡鹏辉刘武杰田克恭国家兽用药品工程技术研究中心

为评价I群禽腺病毒（4型）Fiber-2重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果，本研究利用FAV-HN株Fiber-2基因构建pET-30a-Fiber-2重组质粒，转化至BL21感受态诱导表达Fiber-2重组蛋白；Fiber-2蛋白纯化后制备不同抗原含量的亚单位疫苗，免疫SP... 详细信息

为评价I群禽腺病毒（4型）Fiber-2重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果，本研究利用FAV-HN株Fiber-2基因构建pET-30a-Fiber-2重组质粒，转化至BL21感受态诱导表达Fiber-2重组蛋白；Fiber-2蛋白纯化后制备不同抗原含量的亚单位疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力评价。试验结果表明，Fiber-2蛋白部分为可溶性表达，纯化后纯度约90%，AGP效价达1∶64。亚单位疫苗抗原含量AGP效价不低于1∶2时，SPF鸡免疫后21天AGP抗体10/10阳性，可抵抗Ⅰ群禽腺病毒（4型）强毒株的攻击，提供100%的免疫攻毒保护。

关键词：禽腺病毒 Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫攻毒保护

疱疹病毒引起内质网应激/未折叠蛋白反应研究进展

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中国农业科技导报 2023年第9期25卷 131-139页

作者：蔡海情王微曾茂芹毕文文陈莉张黔东袁阳文明贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物生物制品工程技术研究中心贵阳550025

内质网是真核细胞内蛋白质折叠及翻译后修饰的主要场所,还参与调控Ca^(2+)和脂类物质储存合成,具有重要生理功能。疱疹病毒是一类具有囊膜的DNA病毒,其表面糖基化囊膜蛋白的合成加工依赖于内质网,在病毒复制过程中,大量合成的糖基化囊... 详细信息

内质网是真核细胞内蛋白质折叠及翻译后修饰的主要场所,还参与调控Ca^(2+)和脂类物质储存合成,具有重要生理功能。疱疹病毒是一类具有囊膜的DNA病毒,其表面糖基化囊膜蛋白的合成加工依赖于内质网,在病毒复制过程中,大量合成的糖基化囊膜蛋白在内质网内过度堆积则会引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),进而发生未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。某些疱疹病毒可能已经进化出调控UPR的机制,为复制过程创造最佳环境,它们在宿主细胞内复制时,会引起相关内质网UPR信号级联反应,如细胞损伤、炎症反应、细胞凋亡等。综述了内质网应激/未折叠蛋白(ERS/UPR)对病毒的反应机制,从Ⅰ型单纯疱疹病毒、伪狂犬病病毒、马立克病病毒、鸭肠炎病毒和其他疱疹病毒等感染引起ERS分子机制及相关信号通路进行阐述,以期为疱疹病毒相关疫苗和药物作用靶点的研发提供理论依据。

关键词：内质网应激未折叠蛋白反应疱疹病毒

非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2023年第1期50卷 300-309页

作者：张梦杨何健刘阳坤姚伦广南阳师范学院生命科学与农业工程学院南阳473061 河南省畜禽保健品工程技术研究中心南阳473061 河南省动物疫病诊断与综合防控工程技术研究中心南阳473061

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号:MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组... 详细信息

【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号:MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31.54%)。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,经IPTG诱导后,成功表达重组蛋白p37,大小62 ku左右,主要以包涵体形式存在,且能与His单克隆抗体发生反应。间接ELISA结果显示,制备的鼠源多克隆抗体效价为1∶256000。Western blotting结果显示,在42 ku左右出现了特异性条带;间接免疫荧光显示出了特异性的红色荧光,表明该多克隆抗体能与重组杆状病毒表达的p37蛋白发生反应,具有较好的特异性。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV p37蛋白,制备了抗ASFV p37蛋白多克隆抗体,重组蛋白具有较好的免疫原性,能产生较强的免疫反应,为后续ASFV p37蛋白结构功能研究、抗体及相关疫苗研发奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) p37蛋白蛋白表达多克隆抗体

超表达CD163的猪诱导性多能干细胞系构建

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农业生物技术学报 2022年第10期30卷 2036-2044页

作者：岳威张炬庆杨昕淳吴晓龙沈巧艳于帅祝振硕王承宝张仕强华进联西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心

CD163作为清道夫受体蛋白，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的最重要细胞受体。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是将外源转录因子导入体细胞后，经重编程获得的具有胚胎干细胞生物学特性的多能干细胞。本研究首先通过慢病毒载体系统将猪(Sus scrofa)源CD163基因转导入猪iPSCs (piPSCs)，建立稳定表达CD163的诱导性多能干细胞系，将其命名为CD163OE-piPSC。病毒侵染实验证实，该细胞株对PRRSV高度易感。碱性磷酸酶染色和细胞群体倍增时间检测及5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)细胞增殖检测证实，CD163基因过表达不影响iPSCs的多能性与增殖能力。本研究获得的细胞株可有效应用于PPRSV与宿主互作的致病机理研究及病毒性疾病的靶标分子筛选。

关键词：基因编辑猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 诱导性多能干细胞(iPSCs) CD163