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液相色谱-串联质谱同时监测猪尿中10种违禁药物

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分析化学 2018年第5期46卷 750-756页

作者：谢景梦孟辰颖李二粉张英侠宋旭琴张媚玉贺利民国家兽药残留基准实验室(华南农业大学)华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室华南农业大学

建立了简单、灵敏、可靠的液相色谱-串联质谱测定猪尿中玉米赤霉醇及其类似物、氯霉素、五氯苯酚等10种违禁物质的分析方法。猪尿样品分别采用冻干法和Qu ECh ERS法前处理,乙腈和5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相,梯度洗脱,分析物经Zorbax ... 详细信息

建立了简单、灵敏、可靠的液相色谱-串联质谱测定猪尿中玉米赤霉醇及其类似物、氯霉素、五氯苯酚等10种违禁物质的分析方法。猪尿样品分别采用冻干法和Qu ECh ERS法前处理,乙腈和5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相,梯度洗脱,分析物经Zorbax SB-C18色谱柱分离,在电喷雾负离子模式下,采用四极杆质谱仪进行多反应监测分析。在实验浓度范围内,10种分析物基质匹配标准曲线线性良好,相关系数(R2)均大于0.99;在5、10及20μg/L添加浓度水平,两种前处理方法所得10种分析物的回收率分别为80.7%~107.7%和73.5%~103.3%,相对标准偏差均低于15%,检出限和定量限分别为0.1~2.0μg/L和0.2~5.0μg/L。本方法可满足生猪体内多种违禁物质的快速筛查监测要求。

关键词：违禁药物冻干法 QuEchERS法液相色谱-串联质谱法猪尿

CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

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华南农业大学学报 2023年第2期44卷 179-186页

作者：谢龙飞肖丹瑜常依张旭财李小申熊文广广东省兽药研制与安全评价重点实验室/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/国家兽医微生物耐药性风险评估实验室/华南农业大学兽医学院/岭南现代农业科学与技术广东省实验室广东广州510642

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的... 详细信息

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISPR-);CRISPR+金葡球菌携带耐药基因、毒力基因的数目显著小于CRISPR-金葡菌。实验室60株金葡菌中,有14株为CRISPR+,46株为CRISPR-;CRISPR+金葡菌携带更少的耐药基因和毒力基因,与公共数据库分析结果一致。对原噬菌体和接合质粒的分析结果显示,CRISPR-菌株携带更多的原噬菌体序列,与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05);接合质粒方面,CRISPR-和CRISPR+菌株无显著性差异。【结论】CRISPR结构可能限制了金葡菌中耐药基因和毒力基因的水平转移,CRISPR-菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究为进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播提供了参考。

关键词：金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas系统耐药基因毒力基因

广东省某大型养鸡场tet(X4)阳性大肠杆菌流行分布特征

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中国兽医学报 2023年第12期43卷 2534-2539页

作者：路洋张捷蔡萍沈祥广蒋红霞徐晓立华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642 华南农业大学测试中心广东广州510642

2020年8月从广东省某大型养鸡场不同区域采集粪便、土壤、水体等样品共654份,进行替加环素耐药大肠杆菌的分离鉴定;PCR方法检测替加环素耐药大肠杆菌的tet(X4)基因;PFGE分型检测tet(X4)阳性大肠杆菌的克隆传播情况;采用琼脂二倍稀释法... 详细信息

2020年8月从广东省某大型养鸡场不同区域采集粪便、土壤、水体等样品共654份,进行替加环素耐药大肠杆菌的分离鉴定;PCR方法检测替加环素耐药大肠杆菌的tet(X4)基因;PFGE分型检测tet(X4)阳性大肠杆菌的克隆传播情况;采用琼脂二倍稀释法和肉汤二倍稀释法测定tet(X4)阳性大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);接合转移试验检测tet(X4)水平传播情况。结果显示,共分离得到204株替加环素耐药大肠杆菌,检测出165株tet(X4)阳性大肠杆菌,检出率为25.23%(165/654)。根据菌株来源和分离率,挑选72株进一步研究tet(X4)阳性大肠杆菌在该养鸡场的流行特征。PFGE分型将72株tet(X4)阳性大肠杆菌分为39个簇,表明该养鸡场无明显克隆传播现象。tet(X4)阳性大肠杆菌对替加环素的MIC范围为8~16 mg/L,且表现多重耐药表型,对四环素、多西环素、米诺环素、氨苄西林、氟苯尼考均表现高水平耐药,而对黏菌素、美罗培南均敏感。接合转移试验表明,tet(X4)阳性大肠杆菌主要位于IncHI1型质粒上(93.06%)。结果表明,tet(X4)基因在该养殖场主要随IncHI1质粒传播,提示应加强养殖场大肠杆菌tet(X4)的监测。

关键词：大肠杆菌替加环素 tet(X4)

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高效液相色谱法测定猪排泄物中帕托珠利

华南农业大学学报 2021年第1期42卷 34-41页

作者：聂晶晶王文湘华成云梁立杰黄显会华南农业大学兽医学院/广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642

【目的】建立高效液相色谱(HPLC)结合二极管阵列检测器(PDA)检测猪排泄物中帕托珠利的方法。【方法】尿液样品用0.2%(φ)乙酸酸化乙腈和二氯甲烷进行2次提取;粪便样品经乙腈涡旋提取,亲水−亲油平衡(HLB)固相萃取柱净化。流动相为0.005 m... 详细信息

【目的】建立高效液相色谱(HPLC)结合二极管阵列检测器(PDA)检测猪排泄物中帕托珠利的方法。【方法】尿液样品用0.2%(φ)乙酸酸化乙腈和二氯甲烷进行2次提取;粪便样品经乙腈涡旋提取,亲水−亲油平衡(HLB)固相萃取柱净化。流动相为0.005 mol/L磷酸二氢钾溶液(A)−乙腈(B),尿液和粪便样品的流动相比例V(A)∶V(B)分别为55∶45和56∶44。检测波长为255 nm,柱温为35℃,进样量为30μL。【结果】猪尿液中帕托珠利的检测限和定量限分别为0.02和0.05μg/mL,在0.05~5.00μg/mL范围内呈良好的线性关系,决定系数(R2)为0.9998;在3个添加剂量(0.05、1.00和5.00μg/mL)下,帕托珠利在猪尿液中的平均回收率为93.49%~99.16%,批内和批间相对标准偏差(RSD)为0.97%~7.62%。猪粪便中帕托珠利的检测限和定量限分别为0.10和0.25μg/g,在0.25~100.00μg/g范围内呈良好的线性关系,R2为0.9995;在3个添加剂量(0.25、25.00、100.00μg/g)下,帕托珠利在猪粪便中的平均回收率为89.55%~95.88%,批内和批间RSD为1.76%~3.63%。帕托珠利在尿液和粪便样品中的提取回收率均大于89.50%,批内和批间RSD均小于8%。【结论】本研究方法对样品的前处理操作简单、灵敏度高,可用于猪排泄物中帕托珠利的检测分析。

关键词：帕托珠利高效液相色谱猪排泄物回收率精密度稳定性

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

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中国农业科学 2017年第20期50卷 4021-4027页

作者：梅献万鹏韩东东裴鹏飞曾庆林李晓虹曾振灵华南农业大学兽医学院/广东省兽药研制与安全评价重点实验室

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5... 详细信息

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg,体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg,消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg,体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg,消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P<0.05)健康鸭体内的C,其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。

关键词：氟苯尼考鸭疫里氏杆菌药代动力学腿部感染鸭

广州市流溪河沉积物反硝化细菌群落丰度与结构多样性研究

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华南农业大学学报 2018年第3期39卷 65-72页

作者：邹勇丁雪瑶林曼霞孙永学华南农业大学兽医学院/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642

【目的】研究广州市流溪河沉积物中反硝化细菌的多样性,探讨环境因子对反硝化细菌群落结构和丰度的影响。【方法】通过构建基因文库和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对沉积物中反硝化细菌的群落结构和丰度进行分析,并结合主坐标分析(PCoA)和... 详细信息

【目的】研究广州市流溪河沉积物中反硝化细菌的多样性,探讨环境因子对反硝化细菌群落结构和丰度的影响。【方法】通过构建基因文库和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对沉积物中反硝化细菌的群落结构和丰度进行分析,并结合主坐标分析(PCoA)和冗余分析(RDA)研究反硝化细菌群落与环境因子之间的相关性。【结果】流溪河流域不同采样位点沉积物中nirS型反硝化细菌的组成和丰度存在明显差异。沉积物中大多数nir S序列与已知的反硝化细菌亲缘关系较远,而与其他环境样品中的微生物亲缘关系较近,与流溪河沉积物中nirS反硝化细菌亲缘关系较近的物种有产黄杆菌属Rhodanobacter、副球菌属Paracoccus、Polymorphum gilvum、草螺菌属Herbaspirillum和陶厄氏菌属Thauera。氨氮(NH_4^+–N)和硝酸盐(NO_3~––N)含量对反硝化细菌群落结构起决定性作用。反硝化细菌nirS基因拷贝数范围为8.26×10~1~5.45×10~4 g^(-1),nirS型反硝化细菌数量与化学需氧量(COD)、总氮(TN)、NH_4^+–N、和NO_3~––N含量之间存在显著相关性。【结论】流溪河中化学污染物以及活性氮的大量存在显著影响了反硝化细菌群落结构和多样性。

关键词：反硝化细菌群落结构丰度环境因子流溪河沉积物

外源磺胺二甲嘧啶对施用粪肥的菜地土壤中微生物群落多样性的影响

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华南农业大学学报 2018年第6期39卷 24-31页

作者：王美张文娟郑粤琪陈思远孙永学华南农业大学兽医学院/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室广东广州510642

【目的】明确磺胺二甲嘧啶(SM2)随粪便施入土壤对土壤微生物群落造成的影响,为合理进行养殖场周围土壤环境质量评估和施肥管理提供参考依据。【方法】收集养殖场附近未经抗生素污染的粪便和土壤,构建粪便–土壤模型,设置不同SM2添加剂... 详细信息

【目的】明确磺胺二甲嘧啶(SM2)随粪便施入土壤对土壤微生物群落造成的影响,为合理进行养殖场周围土壤环境质量评估和施肥管理提供参考依据。【方法】收集养殖场附近未经抗生素污染的粪便和土壤,构建粪便–土壤模型,设置不同SM2添加剂量的处理,分别为对照组(0)、低剂量组(5μg·kg^(-1))、中剂量组(500μg·kg^(-1))和高剂量组(5 000μg·kg^(-1)),并分别于粪便和SM2施入1、7、14和50 d后采集土壤样品,采用Biolog技术以及磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)标记法对比分析不同处理组土壤微生物群落的碳源利用能力、菌群结构和功能多样性变化。【结果】SM2的施入提高了土壤微生物群落的总体碳源利用能力,中、高剂量组在施入50 d时对除酯类以外的其他碳源利用能力均强于对照组。低剂量组在施入7 d内对各类碳源利用能力增强,中、高剂量SM2的施入可能会影响土壤群落某些优势物种的繁殖和数量分配。随施入时间的延长,土壤微生物群落对不同剂量SM2反应不同,革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌数量变化显著,放线菌变化不明显。【结论】SM2的施入将长期影响土壤微生物群落的结构与功能多样性。养殖场应及时处理动物排泄物以消除抗生素残留,减少粪肥对土壤环境造成的生态破坏。

关键词：磺胺二甲嘧啶 Biolog技术磷脂脂肪酸标记土壤微生物群落多样性碳源利用

小番茄内生菌耐药基因检测及种植模型中GFP标记菌转移研究

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华南农业大学学报 2018年第4期39卷 55-60页

作者：钟薇馨石珂弋陈意群王晓佩陶皖豫马凯雄孙永学广东省兽药研制与安全评价重点实验室/国家兽药安全评价(环境评估)实验室/华南农业大学兽医学院广东广州510642

【目的】调查广州市售小番茄内生菌中常用抗菌药物耐药基因流行情况及基于绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠埃希菌人工栽种模型探讨耐药基因转移进入小番茄果实内的可能性。【方法】采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法... 详细信息

【目的】调查广州市售小番茄内生菌中常用抗菌药物耐药基因流行情况及基于绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠埃希菌人工栽种模型探讨耐药基因转移进入小番茄果实内的可能性。【方法】采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法分离鉴定市售小番茄内生菌,PCR定性检测内生菌中氯霉素类(cmlA)、四环素类(tetA和tetM)、磺胺类(sul1、sul2和sul3)和喹诺酮类(oqxA、oqxB、qnrB、qnrS和qepA)等药物耐药基因的流行情况;采用GFP标记–大肠埃希菌人工种植模型检测小番茄果实、叶片和根系中目标GFP菌,探讨内生菌及GFP标记进入小番茄内部的可能性。【结果】市售小番茄分离的52株内生菌菌株中,肠杆菌属Enterobacter和克雷伯菌属Klebsiella占有较高比例,几乎所有菌株均携带oqx B基因(总阳性率达92.31%),在人工种植模型第27天采集的果实中分离出含有GFP标记的内生菌。【结论】小番茄内生菌中oqx B基因最为流行,耐药基因可通过根系浇灌的方式转移到小番茄果实内。

关键词：小番茄种植模型耐药基因 GFP标记–大肠埃希菌内生菌

金霉素胁迫下室内粪土模型中菌群多样性与四环素类抗生素耐药基因丰度研究

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华南农业大学学报 2018年第5期39卷 65-73页

作者：邹勇黄蔚虹陈永杰冯慧君李金红任海鑫孙永学国家兽药安全评价(环境评估)实验室/广东省兽药研制与安全评价重点实验室/华南农业大学兽医学院广东广州510642

【目的】探究金霉素在粪土环境中对土壤微生物群落结构多样性和四环素类耐药基因(TRG)丰度的影响。【方法】分别设置金霉素质量0(对照)、10、100、1 000μg作为胁迫剂量,在处理后第1、7、14、28、56天采集样品,使用高通量测序和q PCR技... 详细信息

【目的】探究金霉素在粪土环境中对土壤微生物群落结构多样性和四环素类耐药基因(TRG)丰度的影响。【方法】分别设置金霉素质量0(对照)、10、100、1 000μg作为胁迫剂量,在处理后第1、7、14、28、56天采集样品,使用高通量测序和q PCR技术研究群落结构多样性和TRG丰度的变化。【结果】厚壁菌门能耐受低剂量(10μg)金霉素的毒害作用,对中、高剂量(100、1 000μg)敏感;放线菌门能耐受中、高剂量的毒害作用,生存繁殖具有一定优势;变形菌门的相对丰度除第28天各剂量组均显著低于对照组外,其余时间多显著高于对照组。金霉素–猪粪–土壤模型样品中共检测出3种四环素类抗生素耐药基因(TRGs):tet O、tet T和tet W,3个基因丰度变化趋势相似:与第1天相比,第56天各组TRGs相对含量均显著减少;低剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅱ期高于对照组和中、高剂量组,第7天TRGs相对含量显著高于对照组以及中、高剂量组;中剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅳ期低于其余组,第56天TRGs相对含量显著高于其余组。【结论】在猪粪–土壤环境中,不同菌群对金霉素敏感程度不同,金霉素可改变优势菌群的相对丰度,从而引起菌群群落结构的变化。金霉素可改变TRGs相对含量的日消减率,从而影响TRGs相对含量。本研究可为下一步养殖源性抗菌药物残留的生态风险评估提供一定依据。

关键词：金霉素菌群多样性四环素类抗生素耐药基因丰度日消减率