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猪FoxP3、IL-10双重实时荧光定量PCR方法建立及应用

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畜牧与兽医 2025年第1期 66-73页

作者：王艳萍徐倩倩孟卫芹王金良魏凤董林刘吉山谢金文山东省滨州畜牧兽医研究院山东绿都生物科技有限公司

旨在建立双重实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法，对叉头框蛋白P3（FoxP3）、白细胞介素10（IL-10）的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针，优化引物浓度、退火温度，建立RT-qPCR方法，检测猪圆环病毒2型（... 详细信息

旨在建立双重实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法，对叉头框蛋白P3（FoxP3）、白细胞介素10（IL-10）的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针，优化引物浓度、退火温度，建立RT-qPCR方法，检测猪圆环病毒2型（PCV2）感染外周血调节性T淋巴细胞（Treg）和免疫器官中FoxP3和IL-10的mRNA含量；根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果：建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线，相关系数R2≥0.99;转化生长因子-β（TGF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素17（IL-17）等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线，最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中FoxP3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高，FoxP3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值，IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值，PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中FoxP3和IL-10转录水平升高；Western blot检测表明，FoxP3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天，IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组，与RT-qPCR结果一致。综上，本研究建立的猪FoxP3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点，对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。

关键词： FoxP3 IL-10 实时荧光定量PCR Treg活化免疫负调控

细胞适应性猪流行性腹泻病毒部分基因序列分析及其致病力研究

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畜牧兽医学报 2015年第5期46卷 792-799页

作者：冯晓声刘琪王悦芸周如月安欣宇王贵平贾爱卿广东海大畜牧兽医研究院广州511400

对已经适应Vero细胞生长的猪流行性腹泻病毒CHYJ130330亲本代、第38代、第60代、第80代和第100代病毒的S、M、N基因分别进行测序及序列比对分析,结果显示M和N基因具有高度的保守性,多次传代后未发生氨基酸的改变;S基因在第38代时未发生... 详细信息

对已经适应Vero细胞生长的猪流行性腹泻病毒CHYJ130330亲本代、第38代、第60代、第80代和第100代病毒的S、M、N基因分别进行测序及序列比对分析,结果显示M和N基因具有高度的保守性,多次传代后未发生氨基酸的改变;S基因在第38代时未发生任何突变,第100代时发生了17个核苷酸的点突变,导致15个氨基酸发生改变。动物试验显示,第60代病毒仍能引起仔猪呕吐、腹泻等症状,而第100代的病毒毒力已经减弱。S基因的突变是否与病毒的毒力减弱有关还需进一步试验验证。

关键词：猪流行性腹泻病毒突变 S基因毒力减弱

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副猪嗜血杆菌广东分离株MLST分型研究

中国预防兽医学报 2014年第1期36卷 23-26页

作者：贾爱卿袁子彦何永龙王贵平广东海大畜牧兽医研究院广东广州510630

为了解广东地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)不同分离株的变异程度和菌株之间的亲缘关系。本研究对广东地区分离的21株Hps进行MLST基因分型,利用BURST方法进行分析。结果显示广东地区Hps的7个看家基因均有不同程度的变异,其... 详细信息

为了解广东地区副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)不同分离株的变异程度和菌株之间的亲缘关系。本研究对广东地区分离的21株Hps进行MLST基因分型,利用BURST方法进行分析。结果显示广东地区Hps的7个看家基因均有不同程度的变异,其中6pgd变异率达到100%,7个基因的平均变异率为52.4%,每个菌株均产生了新的ST型。基因的平均距离为0.732,IA值为0.824,与以往的研究结果比较一致。BURST分析表明,这21株菌被分成了10个类群,有几个株菌与欧洲和美洲的分离株均有亲缘关系,分离于同一个猪场同一头猪的分离株,基因型亦存在差异,证明hps不仅流行广泛,变异率也很高。

关键词：副猪嗜血杆菌 MLST 基因分型变异亲缘关系

猪圆环病毒2型Cap蛋白毕赤酵母分泌表达及发酵条件优化

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中国预防兽医学报 2017年第9期39卷 697-700,706页

作者：李中圣伍建敏王凤求侯月娥张杰王贵平广东海大畜牧兽医研究院广东广州511400

为实现猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化... 详细信息

为实现猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化子进行初步筛选和表型鉴定,利用"双膜法"筛选出PCV2 Cap表达量相对较高的酵母。采用正交试验对优选的酵母进行发酵试验,分析培养基pH、甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度和诱导时酵母浓度对PCV2重组Cap蛋白(rCap)分泌表达的影响。结果显示酵母分泌表达PCV2 rCap的优化条件为:培养基pH为5.0,发酵液OD600nm至1.0,加入终浓度1.0%甲醇诱导96 h。优化后的PCV2 rCap分泌量可达207.58μg/m L。中和试验结果显示,发酵产物PCV2 rCap免疫小鼠产生的抗体可有效中和PCV2。本研究为利用酵母表达PCV2 Cap进行疫苗研制奠定了基础。

关键词： PCV2 毕赤酵母表达发酵

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广东地区猪群中猪链球菌流行病学调查分析

中国预防兽医学报 2017年第8期39卷 621-623页

作者：王娟刘琪周如月贾爱卿王贵平广东海大畜牧兽医研究院广东广州511400

为对猪链球菌(SS)病的防控提供参考依据,本研究对广东地区养殖场健康猪群采集的455份样品,屠宰场采集的243份样品和疑似SS发病猪群采集的228份样品进行了SS携带情况统计分析。结果显示,健康猪群、屠宰场屠宰猪群及发病猪群SS的阳性率分... 详细信息

为对猪链球菌(SS)病的防控提供参考依据,本研究对广东地区养殖场健康猪群采集的455份样品,屠宰场采集的243份样品和疑似SS发病猪群采集的228份样品进行了SS携带情况统计分析。结果显示,健康猪群、屠宰场屠宰猪群及发病猪群SS的阳性率分别为42.20%(192/455)、32.10%(78/243)及82.02%(187/228)。血清型定型结果显示,健康猪群共检测到17个血清型,主要以2型和29型为主,分别占18.83%(29/154)和14.94%(23/154),其次为16型,占6.50%(10/154),未定型菌株占31.82%;发病猪群共检测到11个血清型,主要以2型(16.58%)、3型(9.63%)和7型(6.95%)为主,其次为9型(5.34%),未定型菌株占48.66%。对比发现健康猪群和发病猪群携带SS的血清型有所差异,可为临床SS病的预防防控提供参考依据。

关键词：猪链球菌健康猪群发病猪群流行病学分析

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草鱼致病性豚鼠气单胞菌的分离鉴定

中国预防兽医学报 2015年第12期37卷 912-916页

作者：何永龙黄锦炉乔晶鑫王贵平李中圣广东海大畜牧兽医研究院广东广州511490

为鉴定一株引起草鱼（Grass carp）发病的致病菌,并评估其对健康草鱼的致病性和相关药物的敏感性,本研究从患病草鱼病变器官中分离到一株优势菌,对该分离株的形态学、生长特性、生理生化特性、16S rRNA序列等进行鉴定。结果显示：该菌... 详细信息

为鉴定一株引起草鱼（Grass carp）发病的致病菌,并评估其对健康草鱼的致病性和相关药物的敏感性,本研究从患病草鱼病变器官中分离到一株优势菌,对该分离株的形态学、生长特性、生理生化特性、16S rRNA序列等进行鉴定。结果显示：该菌为革兰氏阴性菌,具有β溶血特性,在LB培养基中生长14 h可达7.41×109 cfu/mL,其理化特性与豚鼠气单胞菌基本符合,16S rRNA序列与参考菌株ATCC15468序列同源性在99.5%以上。基于16S rRNA序列进化分析显示,该分离株与豚鼠气单胞菌同属一个分支,亲缘关系较近。该分离菌株对草鱼的半数致死量（LD50）为4.928×106 cfu,对恩诺沙星、卡那霉素、磺胺甲氧嘧啶等药物比较敏感。综合判断该致病菌为豚鼠气单胞菌,命名为JS分离株,对草鱼具有较强致病性,对部分药物较为敏感。

关键词：豚鼠气单胞菌草鱼鉴定药敏试验

猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1主要抗原表位区原核表达及其抗血清中和活性鉴定

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中国兽医学报 2018年第6期38卷 1066-1070页

作者：周如月刘琪冯晓声贾爱卿王贵平广东海大畜牧兽医研究院

本研究利用生物信息学软件预测了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）S1蛋白的1个B细胞中和线性表位。为了验证S1蛋白中该表位的存在，并鉴定其中和活性，构建含有该B细胞线性表位截短S1基因的重组质粒pGEX-4T-S... 详细信息

本研究利用生物信息学软件预测了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）S1蛋白的1个B细胞中和线性表位。为了验证S1蛋白中该表位的存在，并鉴定其中和活性，构建含有该B细胞线性表位截短S1基因的重组质粒pGEX-4T-S1，通过蛋白电泳和Western blot确定该重组质粒可以在原核细胞中表达。将该重组蛋白纯化，免疫BALB／c小鼠，3次免疫后，眼眶静脉采血进行间接免疫荧光及中和试验。结果表明，截短S1蛋白能够引起机体的体液免疫反应，该免疫血清能有效中和PEDV，中和效价为1：64。该研究结果对PEDV免疫机制和新型疫苗的研究具有重要的借鉴意义。

关键词： PEDV S1蛋白间接免疫荧光中和线性表位

广东地区健康猪群和发病猪群猪链球菌流行病学调查分析

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中国畜牧兽医 2017年第6期44卷 1825-1831页

作者：刘琪王娟周如月贾爱卿王贵平广东海大畜牧兽医研究院广州511400

为了解广东地区猪群中猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的流行情况,本研究对在广东地区养殖场采集的228份发病猪群样品及698份健康猪群样品(包括455份鼻拭子样品及243份屠宰场扁桃体样品)进行了SS携带情况的统计分析。结果显示,发病猪... 详细信息

为了解广东地区猪群中猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的流行情况,本研究对在广东地区养殖场采集的228份发病猪群样品及698份健康猪群样品(包括455份鼻拭子样品及243份屠宰场扁桃体样品)进行了SS携带情况的统计分析。结果显示,发病猪群SS的阳性率为82.02%(187/228),健康猪群的SS阳性率为42.20%(192/455),其中屠宰场屠宰猪群的SS阳性率为32.10%(78/243)。将从发病猪群分离到的187株SS及健康猪群(含养猪场和屠宰场)分离得到的154株SS进行血清型定型分析,结果显示,发病猪群共检测到11个血清型,包括SS1、SS2、SS3、SS4、SS7、SS8、SS9、SS16、SS19、SS29和SS31型,主要以SS2、SS3和SS19型为主,分别占16.58%、9.63%和7.49%;其次为SS7型(6.95%)和SS9型(5.34%),未定型菌株占48.66%;健康猪群共检测到17个血清型,包括SS2、SS3、SS4、SS5、SS7、SS8、SS9、SS10、SS12、SS15、SS16、SS17、SS19、SS21、SS23、SS29和SS30型,主要以血清型SS2和SS29型为主,分别占18.83%和14.94%,其次为SS16型(6.50%),未定型菌株占31.82%。

关键词：猪链球菌健康猪群发病猪群流行病学分析

猪链球菌2、7、9型多重PCR检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2016年第3期24卷 35-40页

作者：刘琪王娟周如月甘振磊贾爱卿王贵平广东海大畜牧兽医研究院广州511400

根据Gen Bank中猪链球菌(Streptococcus suis,Ss)2、7、9血清型的荚膜多糖基因簇中的斜基因序列,分别设计3对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立了一种快速区分猪链球菌2、7、9三种血清型的多重PCR检测方法,并... 详细信息

根据Gen Bank中猪链球菌(Streptococcus suis,Ss)2、7、9血清型的荚膜多糖基因簇中的斜基因序列,分别设计3对引物,在完成最佳条件筛选、特异性、敏感性试验的基础上,建立了一种快速区分猪链球菌2、7、9三种血清型的多重PCR检测方法,并对我国广东省分离鉴定的猪链球菌进行分型鉴定。结果表明,建立的多重PCR检测方法分别对猪链球菌血清2型、7型和9型扩增出特异性片段,片段大小分别是360、600、800 bp。该方法特异性良好,与副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)、波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica,Bb)、沙门氏菌(Salmonella,Sal)、大肠杆菌(Escherichia coli,***)以及猪链球菌其他29个血清型均无交叉反应。用建立的多重PCR方法对临床分离的341株猪链球菌菌株进行血清型分型鉴定,并与传统的血清凝集分型结果进行比较,二者符合率为97.36%。与传统的血清凝集方法相比,本研究建立的PCR方法具有快速、灵敏、特异等特点,可应用于实验室的快速诊断以及猪链球菌的流行病学调查。

关键词：猪链球菌多重PCR 血清型鉴定