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基于转录组学分析刺糖多孢菌多杀菌素合成代谢途径关键酶基因挖掘

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微生物学报 2024年第10期64卷 3762-3779页

作者：王晓宇蔡朝辉乔长晟薛超友天津科技大学天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析,探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路,挖掘代谢途径关键酶基因,探究多杀菌素竞争基因簇,为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-144... 详细信息

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析,探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路,挖掘代谢途径关键酶基因,探究多杀菌素竞争基因簇,为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-144 h)进行比较转录组分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)与转录组测序进行相互验证。采用基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对差异表达基因进行功能和代谢通路注释并进行中心碳代谢分析。【结果】刺糖多孢菌通过转录组测序发现有2542个差异表达基因,其中具有显著上调基因1188个,显著下调基因1354个。GO注释表明,差异表达基因主要参与羧酸代谢过程、含氧酸代谢过程、有机酸代谢过程和氨基酸代谢过程。KEGG富集结果表明,差异表达基因主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,以及氧化磷酸化和精氨酸生物合成等通路。进一步分析得到7个与多杀菌素生物合成相关的基因,其中accB、Pfk、G6PD、dsdA表达量显著上调,而涉及多杀菌素前体消耗的GAPDH、aceE、DLAT以及TCA循环和精氨酸生物合成途径中的基因表达量都呈现显著性下调趋势。qRT-PCR与转录组测序结果发现双方同时上调的基因有12个,分别为BGC2(43846 bp)、BGC4(18330 bp)、BGC9(20501 bp)、BGC18(62621 bp)、BGC22(19626 bp)、BGC25(42896 bp)、BGC26(40086 bp)、BGC28(39392 bp)、BGC30(20282 bp)、BGC31(53657 bp)、BGC34(20787 bp)和BGC35(40232 bp)。【结论】本研究通过转录组学分析获得了不同时期刺糖多孢菌的差异基因以及多杀菌素生物合成通路,并分析了刺糖多孢菌中多杀菌素的竞争基因簇,为后期开展多杀菌素生物合成途径的优化和对刺糖多孢菌进行遗传改造从而达到提高多杀菌素产量的目的奠定了基础。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌转录组分析代谢途径实时荧光定量PCR

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抗原受体基因多样性产生机制的起源与演化

中国科学：生命科学 2024年第9期54卷 1581-1594页

作者：元少春黄子文蔡振西黄盛丰徐安龙中山大学生命科学学院广东省药用功能基因研究重点实验室南海海洋生物技术教育部工程研究中心中山大学进化与合成生物学研究中心广州510275

动物免疫系统根据其应答方式及存在形式的不同,可以分为天然免疫和适应性免疫.由于适应性免疫的关键器官/分子(比如胸腺//MHC)等只在有颌类脊椎动物中被发现,因此被认为是生命演化到高级阶段的体现,关于适应性免疫系统的起源一直是演化... 详细信息

动物免疫系统根据其应答方式及存在形式的不同,可以分为天然免疫和适应性免疫.由于适应性免疫的关键器官/分子(比如胸腺//MHC)等只在有颌类脊椎动物中被发现,因此被认为是生命演化到高级阶段的体现,关于适应性免疫系统的起源一直是演化生物学和免疫学研究共同关注的重要问题.本文重点梳理了国内外学者近年来在抗原受体基因多样性产生机制及其演化等方面所取得的进展,尤其是在V(D)J重排机制的转座子起源及RAGL转座子的宿主驯化机制上.本文还总结了无颌类脊椎动物VLR受体及数个进化阶段特有的免疫多样性受体的研究进展.这些研究在完善经典免疫学理论的同时,也为医疗保健领域带来崭新的思路与技术.

关键词：抗原受体基因 RAG V(D)J重排演化

基于酿酒酵母多拷贝系统策略提高三乙酸内酯的生产

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食品与发酵工业 2024年

作者：韦欢林苹鑫刘秀霞刘春立杨艳坤李业白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室韩国科学技术院环境与分子微生物实验室韩国大田广域市

三乙酸内酯(triacetic acid lactone， TAL)是一种具有广泛应用前景的聚酮，可用作各种有机化合物的前体。为了提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中TAL的产量，该研究利用基因组重复序列整合的方法构建了S. cerevisiae多拷贝整... 详细信息

三乙酸内酯(triacetic acid lactone， TAL)是一种具有广泛应用前景的聚酮，可用作各种有机化合物的前体。为了提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中TAL的产量，该研究利用基因组重复序列整合的方法构建了S. cerevisiae多拷贝整合系统，应用该系统提高TAL的生产。首先以绿色荧光蛋白表征多拷贝Delta1整合，通过截短遗传霉素和潮霉素B两种抗生素基因的启动子以及增加抗生素浓度的方法增加筛选压力，进而提高整合效率和拷贝数，最优参数为将抗生素基因启动子截短至15 bp的同时采用160 μg/mL的抗生素。该优化系统随后用于新的多拷贝整合位点Delta2的表征。最后应用该系统合成TAL，通过HPLC分析TAL产量。结果表明，利用Delta1和Delta2序列表征绿色荧光蛋白的最高拷贝数分别为10和7，Delta1略优于Delta2。应用该系统在S. cerevisiae中合成TAL，Delta1和Delta2的产量分别为1.50、1.17 mmol/L，比单拷贝菌株产量分别提高460%和337%。该多拷贝系统有效提高了TAL的产量，为S. cerevisiae异源途径的表达提供了一种高效、模块化的多拷贝整合方法。

关键词：酿酒酵母多拷贝整合 delta整合三乙酸内酯启动子

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猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

中国畜牧兽医 2024年第3期51卷 1223-1231页

作者：李妍花周兵强康笃利郝丽影汪志艳赵少若黄甜庞杏豪刘俊阳楚园园张云静高晓静邓均华田克恭洛阳普泰生物技术有限公司洛阳471000 国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测... 详细信息

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测线和质控线。通过优化胶体金溶液最适pH、标记抗体和检测抗体的最佳使用量,制备PoRV胶体金检测试纸条;对试纸条的灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评价。通过检测50份猪粪便样品,计算试纸条与RT-PCR方法的符合率,最后采用试纸条进行1249份临床样品的测定。【结果】经优化后试纸条的最佳参数如下:胶体金溶液最佳pH为8.0,标记抗体4G5和检测抗体5G4最佳使用量分别为14.4μg/mL和1 mg/mL。试纸条能检测出1∶2000稀释的PoRV OSU株(G5型)病毒液,灵敏度为104.5TCID50/mL,且检测PoRV G9、G3和G4型毒株均为阳性。检测猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)均为阴性。批内和批间重复性、稳定性良好。检测50份猪粪便样品,与RT-PCR方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总体符合率为98%(49/50)。检测2022年在河南、山西省猪场收集的临床样品1249份,阳性检出率为5.2%。【结论】本研究制备的PoRV胶体金检测试纸条具有良好的敏感性、特异性和重复性等优点,与RT-PCR方法的符合率较高,可用于规模化猪场PoRV的快速检测。

关键词：猪轮状病毒(PoRV) 胶体金检测试纸条快速检测

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NAD依赖型甲醇脱氢酶的改造和应用

生物加工过程 2024年

作者：杨金星王钰中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室国家合成生物技术创新中心

一碳原料因其来源广泛且价格低廉，已被视为极具前景的糖基碳源替代品。其中甲醇，更是凭借其价格低廉和便于运输的优势，在生物制造领域广受关注。甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenase， Mdh）是甲醇生物利用的关键限速酶，负责将甲醇... 详细信息

一碳原料因其来源广泛且价格低廉，已被视为极具前景的糖基碳源替代品。其中甲醇，更是凭借其价格低廉和便于运输的优势，在生物制造领域广受关注。甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenase， Mdh）是甲醇生物利用的关键限速酶，负责将甲醇氧化为甲醛。目前，来自不同物种的Mdh已被相继鉴定，为甲醇生物转化提供了多种可供选择的催化元件。其中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+)依赖型Mdh仅由单个基因编码，便于异源表达和改造，反应无需氧气参与，且催化过程伴随着还原力NADH生成，可为生物合成提供驱动力，因此被广泛用于构建人工的甲醇生物转化系统。然而，这类Mdh的催化活性相对较低，限制了甲醇的利用效率。通过新酶挖掘和定向进化等手段获得高活性的Mdh成为一碳原料生物转化利用领域的研究热点之一。本文系统综述NAD+依赖型Mdh的鉴定和进化的相关成果，并简要介绍其在甲醇生物转化中的应用。

关键词：甲醇脱氢酶甲醇生物转化定向进化

贝莱斯芽孢杆菌FH-1通过调控特定时空的土壤微生物组促进水稻苗生长

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微生物学通报 2024年第7期51卷 2381-2410页

作者：代诗佳王敬敬魏茉庞琰杨杨许世武黄志勇天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津工业生物系统与过程重点实验室天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308 农用微生物与药肥创制兵团重点实验室新疆石河子832000

【背景】以植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)为核心的微生物肥料是实现农业可持续发展的重要途径。【目的】以前期获得的一株可显著促进水稻生长的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FH-1为研究对象,运用... 详细信息

【背景】以植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)为核心的微生物肥料是实现农业可持续发展的重要途径。【目的】以前期获得的一株可显著促进水稻生长的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FH-1为研究对象,运用盆栽试验和高通量测序技术,在时空尺度上系统研究了其在复杂土壤系统中的演变规律及其促进水稻生长的微生物生态学机制。【方法】将贝莱斯芽孢杆菌FH-1接种水稻盆栽,在时间和空间尺度分别采取水稻和根际土壤样品,利用直尺和天平测定水稻的株高和植株干重。提取根际土壤DNA后,利用16S rRNA基因扩增子测序解析水稻根际土壤的微生物群落组成,进一步使用Spearman相关统计分析研究水稻-微生物之间的相关性。【结果】接种后第0天,处理组(F)与对照组(CK)间水稻无显著差异。随着时间推移,F组对水稻的促生效果越来越明显。接种后第20天F组中水稻株高和干重分别比CK组高6.02%和12.52%(P生物群落结构和功能促进水稻苗的早期生长。

关键词：植物根际促生菌贝莱斯芽孢杆菌土壤微生物群落时间空间水稻

黄铁矿生物浸出菌群的驯化及其优势物种与功能

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微生物学通报 2024年

作者：王璐赵维成婷婷韩一凡王敬敬张小霞黄志勇天津科技大学生物工程学院中国科学院天津工业生物技术研究所天津市工业生物系统与过程工程重点实验室

【背景】生物浸矿效果与浸矿过程中微生物群落的结构变化密切相关，解析浸矿过程中的微生物群落结构和功能对于进一步认识微生物在浸矿过程中的作用、构建高效菌群具有重要意义。【目的】通过驯化获得稳定高效浸出黄铁矿的微生物菌群，... 详细信息

【背景】生物浸矿效果与浸矿过程中微生物群落的结构变化密切相关，解析浸矿过程中的微生物群落结构和功能对于进一步认识微生物在浸矿过程中的作用、构建高效菌群具有重要意义。【目的】通过驯化获得稳定高效浸出黄铁矿的微生物菌群，并解析其菌群结构和功能。【方法】以黄铁矿为能源来源将微生物菌群在9K培养基中长期传代转接，对比驯化前后菌群的铁硫氧化能力，利用宏基因组测序结合16S rDNA克隆文库对驯化后的菌群进行群落结构解析，通过分化培养实验，探究驯化后菌群中优势微生物在浸出黄铁矿过程中的功能，结合宏基因组功能注释结果分析驯化前后菌群功能基因的变化。【结果】通过为期10代的转接驯化，获得了组成稳定、浸矿功能提升，更加适应黄铁矿浸出环境的微生物菌群。基于宏基因组的结果，驯化后的菌群相对于驯化前，嗜酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)和硫化杆菌属(Sulfobacillus)的比例均上升；16S rDNA克隆文库的检测结果显示，驯化后菌群主要由氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)和耐热硫化芽胞杆菌(Sulfobacillus thermotolerans)两种微生物组成。驯化后菌群的铁氧化能力提升15.15%，硫氧化能力提升70.86%。对菌群的浸矿效果和组成它的优势种属单独的浸矿效果进行比较，以浸出黄铁矿中总铁的含量计算，驯化后5Biol菌群16 d的浸出率可达81.18%，氧化硫硫杆菌(A. thiooxidans)和耐热硫化芽胞杆菌(S. thermotolerans)单独的浸出率分别为51.86%和37.65%，5Bio菌群的浸矿能力优于组成它的优势种属的单独浸矿能力，说明菌群内优势种属之间可能存在协同作用，使得其浸矿效果达到了单物种不能达到的效果。通过分化培养后菌群组成的变化，判断氧化硫硫杆菌(A. thiooxidans)的主要作用是硫的氧化，而耐热硫化芽胞杆菌(S. thermotolerans)的主要作用是铁的氧化，耐热硫化芽胞杆菌(S. thermotolerans)需要依赖氧化硫硫杆菌(A. thiooxidans)的存在才能发挥铁氧化能力，说明菌群中不同物种可能通过协同合作共同提高了浸出黄铁矿的能力，这与5Biol菌群驯化后嗜酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)和硫化杆菌属(Sulfobacillus)的比例提高，浸矿能力得到增强是一致的。对驯化前后与铁硫代谢相关的功能基因进行分析，发现驯化后菌群铁的氧化主要通过sulfocyanin-like蛋白实现，硫的氧化主要通过sox系统、sor系统和非sox子系统实现。【结论】通过长期驯化传代的方法，可以获得组成稳定、功能强化的高效浸矿菌群。由于长期驯化菌群更加稳定，更容易解析其中不同菌种在执行浸矿功能中的作用。这对高效浸矿菌群的构建具有重要的指导意义。

关键词：黄铁矿浸出驯化浸矿菌群氧化硫硫杆菌耐热硫化芽胞杆菌协同作用

菘蓝中松脂醇-落叶松脂素还原酶编码基因IiPLR2的克隆与功能分析

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2270-2281页

作者：李蓉蓉马雪祺肖莹上海中医药大学中药研究所中药新资源与品质评价中管局重点研究室中药资源与生物技术中心上海201203

松脂醇-落叶松脂素还原酶(pinoresinol-lariciresinol reductase,PLR)是植物中木脂素生物合成的关键酶,能连续催化两步反应分别生成落叶松脂素和开环异落叶松脂素。落叶松脂素等木脂素类成分是中药板蓝根发挥抗病毒活性的有效成分。为... 详细信息

松脂醇-落叶松脂素还原酶(pinoresinol-lariciresinol reductase,PLR)是植物中木脂素生物合成的关键酶,能连续催化两步反应分别生成落叶松脂素和开环异落叶松脂素。落叶松脂素等木脂素类成分是中药板蓝根发挥抗病毒活性的有效成分。为了研究板蓝根基原植物菘蓝中落叶松脂素生物合成关键酶PLR的功能,从菘蓝(Isatis indigotica)中克隆得到Ii PLR2基因序列,全长954 bp,编码317个氨基酸;多序列比对分析显示IiPLR2具有保守的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)结合基序;进化树分析显示Ii PLR2与来自拟南芥的AtPrR1聚在同一分支;构建原核表达载体pET32a-IiPLR2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达纯化;体外酶活实验检测发现IiPLR2能够催化松脂醇生成落叶松脂素,并能进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素。IiPLR2编码基因的克隆、序列分析及催化功能研究丰富了菘蓝中该类功能蛋白的认识,完善了菘蓝木脂素生物合成途径,为开展木脂素类成分的代谢调控和合成生物学研究提供了功能元件,也为深入研究该类蛋白的空间结构与催化功能的关系等奠定了基础。

关键词：菘蓝松脂醇-落叶松脂素还原酶木脂素落叶松脂素开环异落叶松脂素

徐长卿根提取物对类风湿性关节炎的治疗作用及分子机制研究

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重庆师范大学学报(自然科学版) 2024年

作者：王晨黄旺香阳陈英朱海婷陈曦雅康敬玲和七一余晓东重庆师范大学生命科学学院教育部活性物质生物技术工程研究中心重庆市生物活性物质工程研究中心

【目的】探究徐长卿(Cynanchum paniculatum)根提取物对类风湿性关节炎(RA)的治疗作用以及揭示其潜在的分子机制。【方法】采用完全弗氏佐剂(CFA)构建抗原诱导性类风湿性关节炎(AIA)大鼠模型，并分别口服给予不同浓度的徐长卿根提取物... 详细信息

【目的】探究徐长卿(Cynanchum paniculatum)根提取物对类风湿性关节炎(RA)的治疗作用以及揭示其潜在的分子机制。【方法】采用完全弗氏佐剂(CFA)构建抗原诱导性类风湿性关节炎(AIA)大鼠模型，并分别口服给予不同浓度的徐长卿根提取物。随后，对大鼠的足跖肿胀、体质量、器官指数进行了测量，同时利用ELISA检测血清中促炎因子的水平，测定脚踝组织中髓过氧化物酶(MPO)含量，并通过RT-qPCR检测核因子-κB(NF-κB)通路关键基因的mRNA表达水平。此外，采用GC-MS对徐长卿根提取物的成分进行了分析鉴定。【结果】与模型组相比，徐长卿根提取物实验组能有效消除大鼠的足趾肿胀，且血清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平以及脚踝组织中的MPO含量明显降低(p基因的mRNA表达水平(p<0.001)，且呈现剂量依赖性。GC-MS结果显示，徐长卿根提取物主要含有丹皮酚、棕榈酸、亚油酸、5-羟甲基糠醛等物质。【结论】徐长卿根提取物表现出良好的RA治疗效果，可能主要通过丹皮酚和亚油酸发挥作用。其治疗分子机制可能涉及调节NF-κB通路。

关键词：徐长卿根提取物类风湿性关节炎模型 NF-κB通路促炎因子 GC-MS