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环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造及其在合成α-熊果苷中的应用

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1845-1855页

作者：刘嘉琦谭明董钧刘以银刘珊娜吴洽庆天津农学院食品科学与生物工程学院天津300392 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值,但从植物组织中提取产率低,极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase),以... 详细信息

熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值,但从植物组织中提取产率低,极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase),以麦芽糊精为供体,对苯二酚为受体,催化合成α-熊果苷。通过定点饱和突变和定点突变筛选到突变体Ag CGTase-F235G-N166H,活力是野生型的3.48倍。通过优化反应pH、温度、对苯二酚添加量,转化率在最优反应条件下达到63%。综上所述,本研究成功构建了一株能高效合成α-熊果苷并具有较高苯二酚转化率的菌株,对于降低α-熊果苷工业化的生产成本,提高产物的转化率方面具有重要的应用潜力。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶 α-熊果苷定点突变麦芽糊精对苯二酚

基于结构信息的MHET降解酶挖掘及温和温度下的酶级联塑料降解

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生物工程学报 2024年第3期40卷 773-785页

作者：刘欣悦耿文超孙瑨原陈泽华崔颖璐吴边中国科学技术大学生命科学与医学部安徽合肥230027 中国科学院微生物研究所、微生物资源前期开发国家重点实验室、中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室北京100101 南开大学化学学院天津300071 中国科学院天津工业生物技术研究所、中国科学院系统微生物工程重点实验室天津300308

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)的不规范使用和处置造成了严重的生态污染。酶法降解是一种环境友好的解决PET污染的方法。对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]是PET降解过程中的... 详细信息

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)的不规范使用和处置造成了严重的生态污染。酶法降解是一种环境友好的解决PET污染的方法。对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]是PET降解过程中的具有竞争性抑制效果的中间产物,可由MHET降解酶催化水解。本研究采用生物信息学方法,结合序列和结构信息,发现了一种MHET水解酶,BurkMHETase。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为7.5和40℃,在pH 7.5−10.0、30−45℃条件下相对稳定;以MHET为底物测定动力学参数kcat为(24.2±0.5)s^(-1),Km为(1.8±0.2)μmol/L,具有与目前最高效的IsMHETase相似的kcat值和更高的底物亲和力。BurkMHETase与PET降解酶IsPETase联用能够改善PET薄膜的降解效果。结构分析和突变实验表明,BurkMHETase可能已经进化出特定的结构特征来催化MHET的水解。对于MHET降解酶,在495位为芳香族氨基酸以及活性部位或远端氨基酸间的协同相互作用对于MHET水解活性似乎是必需的。因此,BurkMHETase有潜力应用于PET双酶降解系统,而所使用的生物信息学方法可以用来高效挖掘新的MHET降解酶。

关键词：聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料生物降解酶挖掘丝氨酸水解酶

浒苔多糖对脂多糖诱导小鼠肠道屏障功能及肠道微生物组成的影响

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食品科学 2024年第3期45卷 34-41页

作者：张玉梅谢春艳吴信中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室湖南长沙410125 天津市农业科学院畜牧兽医研究所天津300381 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

目的:研究浒苔多糖(Enteromorpha prolifera polysaccharide,EP)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠肠道屏障功能及微生物组成的影响。方法:选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠48只,随机分为4组,每组12只,分别为空白对照(Ctrl)组、LPS组、EP组、EP+LPS组,Ctrl和LPS组小鼠饲喂基础日粮,EP和EP+LPS组饲喂含600 mg/kg EP的日粮,28 d后,LPS和EP+LPS组小鼠按0.5 mg/kg mb腹腔注射200μL LPS,Ctrl和EP组小鼠腹腔注射相同剂量的生理盐水。结果:EP处理4周对LPS诱导的小鼠肝脏损伤和脾脏肿大没有显著影响;EP处理能显著降低LPS诱导小鼠的血清中髓过氧化物酶(P酶(P酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的基因表达(P生物的组成减缓小鼠的肠道屏障损伤。

关键词：浒苔多糖脂多糖炎症肠道屏障肠道微生物

莨菪碱6β-羟化酶，一种潜在的多功能氧化酶催化剂

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生物工程学报 2024年

作者：陈曦吴洽庆朱敦明中国科学院天津工业生物技术研究所国家合成生物技术创新中心

2-酮戊二酸/Fe2+依赖的双加氧酶能够实现复杂结构化合物sp3杂化C-H键的官能化反应，并且反应条件温和，对底物具有高度的区域和立体选择性。莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase， H6H)属于此类双加氧酶，是催化合成东莨菪碱... 详细信息

2-酮戊二酸/Fe2+依赖的双加氧酶能够实现复杂结构化合物sp3杂化C-H键的官能化反应，并且反应条件温和，对底物具有高度的区域和立体选择性。莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase， H6H)属于此类双加氧酶，是催化合成东莨菪碱的最后两步的关键酶，依次实现莨菪碱的6β-羟化和6，7位的环氧化反应。本文介绍了莨菪碱6β-羟化酶催化机制、底物谱和应用进展，对该酶转化不同结构特点底物的羟化、环氧化等反应的潜在能力进行了评估，为后续对酶的设计改造和应用研究提供理论基础。

关键词： 2-酮戊二酸/Fe 依赖的双加氧酶莨菪碱6β-羟化酶催化机制底物谱

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高通量技术在萜类合成酶筛选中的应用

微生物学报 2024年第2期64卷 408-431页

作者：李贝邓子新徐敏侯安伟中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308 合成生物学海河实验室天津300308 江西省科学院微生物研究所江西南昌330096

萜类化合物种类繁多,生物活性多样,在食品、药品与化妆品等行业中具有广泛的应用。萜类化合物多来源于植物,然而随着合成生物学的快速发展,相较于传统的天然植物提取与化学合成方法,利用工程微生物进行萜类化合物异源合成的方法显得更... 详细信息

萜类化合物种类繁多,生物活性多样,在食品、药品与化妆品等行业中具有广泛的应用。萜类化合物多来源于植物,然而随着合成生物学的快速发展,相较于传统的天然植物提取与化学合成方法,利用工程微生物进行萜类化合物异源合成的方法显得更为经济与环保。萜类合成酶的催化活性及合成产物的结构特性是萜类化合物异源合成的关键。通过蛋白定向进化与理性设计可以有针对性地优化萜类合成酶的催化性能及产物专一性,但该方案需要一个特异的筛选方法来实现蛋白突变体库的高通量筛选。近年来,一系列高通量筛选方法的建立使得萜类合成酶的筛选变得更加灵敏与高效。本文对近期建立的萜类合成酶高通量筛选方法进行了综述,简要概述了各种筛选方法的基本原理与优缺点,并对高通量筛选技术在萜类合成酶改造中的应用做出了展望。

关键词：高通量筛选萜类合成酶定向进化萜类化合物

1，3-丙二醇的微生物合成：C6-C3-C1原料体系的转变

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生物工程学报 2024年

作者：果士婷刘盼王钰中国科学院天津工业生物技术研究所低碳合成工程生物学重点实验室国家合成生物技术创新中心

1，3-丙二醇（1，3-propanediol， 1，3-PDO）是一种具有广泛应用价值的二元醇化合物，可用于多种医药中间体、食品和化妆品的制造，也是合成纤维材料聚对苯二甲酸丙二醇酯的关键单体。微生物转化葡萄糖等可再生原料合成1，3-PDO因具有... 详细信息

1，3-丙二醇（1，3-propanediol， 1，3-PDO）是一种具有广泛应用价值的二元醇化合物，可用于多种医药中间体、食品和化妆品的制造，也是合成纤维材料聚对苯二甲酸丙二醇酯的关键单体。微生物转化葡萄糖等可再生原料合成1，3-PDO因具有环境友好、高效节能、安全可持续等优点，已实现产业化，是微生物化学品工厂设计与应用的成功案例。但是，粮食紧缺和气候变化等问题正在推动化学品生物制造的原料朝着非粮化、低成本、可持续的方向转变。微生物转化C3原料甘油合成1，3-PDO的研究已较为深入。近年来，以能量密度更高的甲醇等C1原料合成1，3-PDO也受到广泛关注，多条新的人工合成途径被创建并成功验证，为1，3-PDO可持续生物合成奠定了基础。本文重点从C6-C3-C1原料体系转变的角度综述了1，3-PDO的微生物合成研究进展，对不同原料体系下提升1，3-PDO合成效率的代谢途径改造策略进行了讨论，并对C1原料合成1，3-PDO的发展前景进行了展望。

关键词： 1，3-丙二醇可再生原料葡萄糖甘油甲醇

本氏烟草悬浮细胞NBS-1的创建及底盘特征分析

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1935-1949页

作者：张方晴史佳欣于静赵玥范荣王晓伟李志超天津科技大学生物工程学院天津300457 国家合成生物学技术创新中心天津300308 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势,但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术,其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产... 详细信息

植物合成生物学在植物天然产物的发掘制造方面具有明显的理论优势,但因缺乏高效的底盘系统及相关使能技术,其对生物合成领域的贡献有限。最常用的植物底盘——烟草由于操作周期长、改造难度大、代谢及纯化背景复杂、烟碱毒性和农业生产难精准控制等问题,而烟草悬浮细胞底盘体系可有效解决上述问题。本研究旨在开发出生长快速、生物量高、分散度好、转化效率高、烟碱含量极低并具备较高科研价值及工业化潜力的烟草悬浮细胞底盘。选取分子技术高适用性的本氏烟草(Nicotiana benthamiana),诱导获得的悬浮细胞NBS-1生长迅速、分散性好,最高生物量可达到476.39g/L(鲜重),各项参数均远超常用的烟草BY-2(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)细胞系。常用的pEAQ-HT高效瞬时表达系统在NBS-1中的转化表达效率可达81%,远高于BY-2。利用转录组数据对BY-2和NBS-1的代谢特征及偏好性进行分析,发现NBS-1的黄酮类等化合物合成通路基因的表达显著高于BY-2,且NBS-1的生物碱合成通路基因的表达显著低于BY-2,并通过代谢物含量测定实验验证了该分析结果,表明NBS-1极低烟碱含量的同时,为该底盘对应产品的选择提供参考。综上,本研究开发出的生长转化优异、黄酮类含量较高且烟碱含量极低的本氏烟草悬浮细胞底盘NBS-1,对于开发烟草悬浮细胞底盘有重要指导意义。

关键词：植物底盘悬浮细胞本氏烟草生物量瞬时表达烟碱黄酮

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一种新型聚酰胺水解酶的鉴定和性质研究

生物工程学报 2024年

作者：郑芷然丛琳李志帅刘卫东游松韩旭沈阳药科大学生命科学与生物制药学院中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程研究中心国家合成生物技术创新中心中国科学院大学

不可自然降解塑料的广泛应用对生态环境的危害日益严峻，塑料高聚物污染物已成为生态环境治理的焦点，其中利用酶等生物法对高聚物进行解聚具有一定优势，不仅反应条件温和，解聚产物还可以进行回收进入再循环。近年来在塑料的生物解聚... 详细信息

不可自然降解塑料的广泛应用对生态环境的危害日益严峻，塑料高聚物污染物已成为生态环境治理的焦点，其中利用酶等生物法对高聚物进行解聚具有一定优势，不仅反应条件温和，解聚产物还可以进行回收进入再循环。近年来在塑料的生物解聚研究中，对聚酯型塑料聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate， PET)和聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene adipate terephthalate， PBAT)等研究较多，发现了许多高效率解聚酶，但对于基于酰胺键的聚酰胺塑料生物解聚酶的报道较少。本研究使用4-硝基丙酰苯胺为模式底物，筛选实验室建立的塑料解聚酶库，获得了一个来源于红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的能水解酰胺键的MrABH，将其在大肠杆菌中进行了表达，并利用亲和层析技术纯化获得了纯度较高的酶，对其催化性质、酶学性质以及催化聚酰胺的产物进行了研究，发现MrABH在pH 8.0-10.0都有良好的稳定性，其最适pH为9.0、最适温度为30 ℃；动力学分析表明其对酯键和酰胺键的催化效果相近，MrABH能解聚PA6和PA66生成单体和寡聚物，未来有潜力应用于聚酰胺的生物解聚和再循环利用。

关键词：聚酰胺聚酰胺水解酶表达纯化酶学性质

基于转录组学分析刺糖多孢菌多杀菌素合成代谢途径关键酶基因挖掘

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微生物学报 2024年

作者：王晓宇蔡朝辉乔长晟薛超友天津科技大学中国科学院天津工业生物技术研究所

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析，探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路，挖掘代谢途径关键酶基因，探究多杀菌素竞争基因簇，为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-... 详细信息

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析，探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路，挖掘代谢途径关键酶基因，探究多杀菌素竞争基因簇，为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-144 h)进行比较转录组分析，并通过实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR， qRT-PCR)与转录组测序进行相互验证。采用基因本体论(gene ontology， GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)对差异表达基因进行功能和代谢通路注释并进行中心碳代谢分析。【结果】刺糖多孢菌通过转录组测序发现有2 542个差异表达基因，其中具有显著上调基因1 188个，显著下调基因1 354个。GO注释表明，差异表达基因主要参与羧酸代谢过程、含氧酸代谢过程、有机酸代谢过程和氨基酸代谢过程。KEGG富集结果表明，差异表达基因主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及氧化磷酸化和精氨酸生物合成等通路。进一步分析得到7条与多杀菌素生物合成相关基因，其中accB、Pfk、G6PD、dsdA表达量显著上调，而涉及多杀菌素前体消耗的GAPDH、aceE、DLAT以及TCA循环和精氨酸生物合成途径中的基因表达量都呈现显著性下调趋势。qRT-PCR与转录组测序结果发现双方同时上调的基因有12个，分别为BGC2 (43 846 bp)、BGC4 (18 330 bp)、BGC9 (20 501 bp)、BGC18 (62 621 bp)、BGC22 (19 626 bp)、BGC25 (42 896 bp)、BGC26 (40 086 bp)、BGC28 (39 392 bp)、BGC30 (20 282 bp)、BGC31 (53 657 bp)、BGC34 (20 787 bp)和BGC35 (40 232 bp)。【结论】本研究通过转录组学分析获得了不同时期刺糖多孢菌的差异基因以及多杀菌素生物合成通路，并分析了刺糖多孢菌中多杀菌素的竞争基因簇，为后期开展多杀菌素生物合成途径的优化和对刺糖多孢菌进行遗传改造从而达到提高多杀菌素产量的目的奠定了基础。

关键词：多杀菌素刺糖多孢菌转录组分析代谢途径实时荧光定量PCR