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双功能铜催化全取代烷基烯基醚的可控合成

有机化学 2024年第3期44卷 1043-1044页

作者：郑汉良朱钢国浙江师范大学化学与材料科学学院、先进催化材料教育部重点实验室浙江金华321004

烷基烯基醚(AVEs)是一类重要的有机合成砌块,被广泛应用于天然产物和高分子聚合物的合成[1-2].由于其多样的生物和药物活性,AVEs也常作为一种药效团而被大量引入药物候选化合物中(图1).因此,发展AVEs的高效合成策略具有重要意义.AVEs的... 详细信息

烷基烯基醚(AVEs)是一类重要的有机合成砌块,被广泛应用于天然产物和高分子聚合物的合成[1-2].由于其多样的生物和药物活性,AVEs也常作为一种药效团而被大量引入药物候选化合物中(图1).因此,发展AVEs的高效合成策略具有重要意义.AVEs的经典合成方法包括烯基醚的Heck芳基化反应[3]、钯催化炔基醚的可控氢芳基化反应[4]以及高价碘介导的炔烃烷氧-碘化反应[5].尽管这些方法为AVEs的制备提供了有效的途径,但是全取代AVEs的区域与立体选择性合成还面临挑战.

关键词：芳基化反应碘化反应烯基醚钯催化高价碘立体选择性合成药物活性药效团

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原核Argonaute的应用研究进展

华中农业大学学报 2024年第4期43卷 82-93页

作者：王飞李文强刘洋王珑瑜陈晚苹崔佳凯马立新省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室/工业生物技术湖北省重点实验室/湖北大学生命科学学院武汉430062

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬... 详细信息

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

关键词：可编程核酸酶原核Argonaute 基因编辑分子诊断 DNA组装

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异源CYP450酶的表达优化促进工程酿酒酵母合成熊果酸

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化工学报 2024年第7期75卷 2624-2632页

作者：那雪梅王雨姜尧竹贾男王颖李春北京理工大学化学与化工学院医药分子科学与制剂工程工信部重点实验室北京100081 清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室北京100084

熊果酸(UA)是具有多种生理及药理活性的植物来源五环三萜类羧酸,尽管在酿酒酵母中已经实现了UA的从头合成,但仍存在产量低、副产物积累、营养供给冗余等问题,无法实现工业化生产。为了提高酿酒酵母合成熊果酸的能力,通过多种方法优化了U... 详细信息

熊果酸(UA)是具有多种生理及药理活性的植物来源五环三萜类羧酸,尽管在酿酒酵母中已经实现了UA的从头合成,但仍存在产量低、副产物积累、营养供给冗余等问题,无法实现工业化生产。为了提高酿酒酵母合成熊果酸的能力,通过多种方法优化了UA合成途径中异源CYP450酶的表达。探究了位置效应对CYP450基因表达的影响,初步筛选到CYP450的基因组最佳整合位点(HO位点),通过单独增加CYP450的拷贝数或同时增加CYP450及CPR的拷贝数,确定了同时存在3个CYP450和CPR拷贝时CYP450酶具有最佳催化活性,进行培养基优化后UA摇瓶产量达到(266.54±6.50)mg/L,最终在5 L发酵罐进行放大培养UA产量达到(2825.58±36.26)mg/L。本研究可为在酿酒酵母中通过表达优化策略调控其他三萜类化合物的合成提供参考。

关键词：位置效应熊果酸酿酒酵母代谢发酵合成生物学

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基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

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芳香杂环酮还原酶的基因挖掘及催化性质

微生物学通报 2024年

作者：薛佳钰许国超倪晔江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

【背景】(R，S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙醇(NEB-8(R，S))是奈必洛尔的重要手性中间体，由芳香杂环酮还原酶不对称合成。而目前的天然酮还原酶催化效率低，对映选择性差，商业酮还原酶来源不明确，反应转化率低... 详细信息

【背景】(R，S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙醇(NEB-8(R，S))是奈必洛尔的重要手性中间体，由芳香杂环酮还原酶不对称合成。而目前的天然酮还原酶催化效率低，对映选择性差，商业酮还原酶来源不明确，反应转化率低。【目的】研究具有高对映选择性、稳定性良好、催化效率优异的酮还原酶实现NEB-8(R，S)的高效不对称合成。【方法】基于已有的酮还原酶的蛋白质序列，通过基因挖掘，获得了来源于玫瑰谦虚杆菌（Modestobacter roseus）的酮还原酶基因mradh，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达，测定其对映选择性，表征其酶学性质，并优化它在高浓度底物下的反应。【结果】论文筛选获得了一种新型酮还原酶MrADH，其属于中链醇脱氢酶超家族，兼具氧化和还原能力。MrADH的氧化、还原活性的最适pH值分别为9.5和7.0；对于酮酯类底物、间位取代芳香酮、杂环酮和仲醇等底物，MrADH具有良好的还原氧化活性；此外，在40 ℃条件下，MrADH半衰期可长达207 h，显示出良好的热稳定性。MrADH能够高效地催化还原600 mmol/L的(S)-2-氯-1-(6-氟-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-2-基)-乙酮，以接近100%的对映体过量（ee）和99.7%的转化率合成产物醇。【结论】来源于M. roseus的酮还原酶可以高效合成高光学纯度的盐酸奈必洛尔中间体，为奈必洛尔的合成奠定了基础。

关键词：基因挖掘芳香杂环酮还原酶高立体选择性 MrADH 奈必洛尔

培养温度对长双歧杆菌婴儿亚种B8762分裂周期的影响

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食品与发酵工业 2024年

作者：杨展姚国强刘凯龙张晓源裴启林李民张和平内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室乳品生物技术与工程重点实验室

双歧杆菌在增殖培养中存在营养充足但增殖受限的情况，因此探究其增殖过程中的分裂周期至关重要。该研究选择长双歧杆菌婴儿亚种B8762为研究对象，采用荧光探针对菌体细胞进行标记，并通过流式细胞术对该菌株在不同温度下的分裂进程及... 详细信息

双歧杆菌在增殖培养中存在营养充足但增殖受限的情况，因此探究其增殖过程中的分裂周期至关重要。该研究选择长双歧杆菌婴儿亚种B8762为研究对象，采用荧光探针对菌体细胞进行标记，并通过流式细胞术对该菌株在不同温度下的分裂进程及膜结构完整性进行了研究。结果表明，在10 μmol/L 荧光染料标记下，菌株表现出良好的生长状况，满足分裂过程的指标测定。此外，在不同培养条件下，各世代细胞群体的分布存在差异，表明菌体分裂过程持续进行，且各世代菌体分裂不同步，高温下“6”世代的群体数量相较于37 ℃上涨了142.31%。菌株的生理状态受到培养温度的影响较大，高温下膜结构完整性损失比例增大了 168.82%。该研究揭示了双歧杆菌增殖分裂过程中的荧光信号变化及菌体细胞活性的差异，为高活性乳酸菌的工业化生产提供了理论指导。

关键词：长双歧杆菌婴儿亚种荧光示踪分裂周期膜完整性菌体形态

纳米纤维素-聚乙烯亚胺-聚吡咯复合气凝胶对Cr(VI)的光催化还原及循环吸附

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复合材料学报 2024年第6期41卷 3032-3041页

作者：杨明琰蔡晓丹陈欣玥安琳玉邢建宇长安大学水利与环境学院西安710054 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室西安710054 水利部旱区生态水文与水安全重点实验室西安710054

吸附与光催化还原相结合可以在光照条件下将Cr(VI)还原成低毒性的Cr(III)并固定在吸附材料中,是一种很有前景的铬污染治理方法。本文以纳米纤维素-聚乙烯亚胺气凝胶(CPA)为骨架,通过吡咯原位氧化聚合制得纳米纤维素-聚乙烯亚胺-聚吡咯(C... 详细信息

吸附与光催化还原相结合可以在光照条件下将Cr(VI)还原成低毒性的Cr(III)并固定在吸附材料中,是一种很有前景的铬污染治理方法。本文以纳米纤维素-聚乙烯亚胺气凝胶(CPA)为骨架,通过吡咯原位氧化聚合制得纳米纤维素-聚乙烯亚胺-聚吡咯(CPP-F)光敏感复合气凝胶。采用SEM、FTIR、UV-vis、XPS对气凝胶进行表征。通过黑暗及光照条件的对比,研究了CPP-F复合气凝胶对Cr(VI)的吸附、光催化原位还原及循环吸附性能,并对其循环吸附机制进行了分析。结果表明:CPP-F为黑色、结构均匀稳定的多孔气凝胶,在紫外、可见光和近红外区域均有较强的光吸收。负载Cr(VI)的CPP-F经光照处理后,Cr(III)含量由黑暗条件下29.76wt%上升至72.33wt%,其还原率是黑暗条件下的2.43倍,表明聚吡咯(PPy)具有优异的光催化性能,光照处理可促进Cr(VI)的原位还原。经过6次循环吸附,光照处理下CPP-F对Cr(VI)的循环吸附量比黑暗处理高64.97%,其原因可能是光催化还原产生的Cr(III)为Cr(VI)提供了新的吸附位点,促进了Cr(VI)的循环吸附。吸附-光催化还原-循环吸附相结合的方法比单一吸附法更具优势,在Cr(VI)污染治理方面有很大的应用潜力。

关键词：光催化纳米纤维素气凝胶聚吡咯 Cr(VI) 光还原循环吸附

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分子改造甲烷八叠球菌醇脱氢酶催化合成4-羟基-2-丁酮

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应用与环境生物学报 2024年

作者：张笛张恒维张迪杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍... 详细信息

4-羟基-2-丁酮(4H2B)是一种重要的药物中间体，可以用于合成抗HIV药物度鲁特韦重要手性中间体(R)-3-氨基丁醇，但4H2B价格昂贵，本研究旨在通过酶催化反应，将廉价的1，3-丁二醇(1，3-BDO)催化合成4H2B，以便用于后续开发合成4H2B的衍生物。首先克隆表征了一种甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)来源的醇脱氢酶(MeADH)，研究发现，其可用于催化1，3-BDO合成4H2B。MeADH最适催化温度为60 ℃，最适催化pH为10.0。经酶学性质分析发现，MeADH在最适反应温度60 ℃下孵育48 h仅剩7.51%左右残余酶活力，说明其热稳定性不佳。基于计算机辅助设计选择了15个突变位点，筛选得到一个双突变MeADHE246P/T296P，在60 ℃条件下孵育48 h，其残余酶活为初始酶活的40.27%左右，比原始酶提高了5.36倍。此外，MeADH催化反应过程中需要辅酶NADP+，本文通过引入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)来源的NADH氧化酶(LrNox)突变体LrNoxL179S构建了NADP+辅酶循环体系，并将其应用到4H2B的生物合成中。通过优化反应条件和底物流加实验，4H2B合成量最高达到2.2 g/L左右，为后续进行高效生物合成4-羟基-2-丁酮及其衍生物的研究奠定了基础。(图10 表3 参29)

关键词： 4-羟基-2-丁酮醇脱氢酶辅酶循环再生热稳定性

代谢工程改造热带假丝酵母高效合成1，2，4-丁三醇

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微生物学通报 2024年

作者：李静芸夏媛媛沈微杨海泉陈献忠江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

【背景】1，2，4-丁三醇是一种手性多羟基醇，作为一种关键的平台化合物，主要用于合成高能材料1，2，4-三硝酸酯丁三醇，这种材料可作为飞机、火箭和导弹等武器的推进剂。随着合成生物学的快速发展，利用微生物细胞工厂生产1，2，4-丁... 详细信息

【背景】1，2，4-丁三醇是一种手性多羟基醇，作为一种关键的平台化合物，主要用于合成高能材料1，2，4-三硝酸酯丁三醇，这种材料可作为飞机、火箭和导弹等武器的推进剂。随着合成生物学的快速发展，利用微生物细胞工厂生产1，2，4-丁三醇受到越来越多的关注。【目的】本研究以前期构建的产1，2，4-丁三醇热带假丝酵母工程菌为出发菌株，通过代谢工程策略进一步优化人工途径，降低中间产物积累，提高1，2，4-丁三醇发酵水平，并评价工程菌利用廉价的玉米芯水解液发酵生产1，2，4-丁三醇的能力。【方法】通过启动子工程，优化木糖脱氢酶基因表达水平，减少木糖酸中间产物的积累。利用碳酸钙作为中和剂调节发酵过程的pH，以及通过发酵培养基铁离子浓度优化等策略，提高热带假丝细胞工厂合成细胞工厂发酵生产1，2，4-丁三醇的能力。【结果】与出发菌株相比，构建的工程菌发酵生产1，2，4-丁三醇的产量提高了37%，5-L发酵罐上产量达到6.2 g/L。同时，工程菌以玉米芯水解液作为原料能够生产出2.6 g/L的1，2，4-丁三醇。【结论】本研究通过代谢工厂策略和发酵过程优化，提高了热带假丝酵母合成1，2，4-丁三醇的能力，还首次评价热带假丝酵母细胞工厂利用玉米芯水解液合成1，2，4-丁三醇的可行性，为大规模地利用生物质原料发酵生产1，2，4-丁三醇挖掘出一个有潜力的宿主。

关键词： 1,2,4-丁三醇木糖酸积累热带假丝酵母生物质原料发酵优化