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鱼类鼻黏膜相关淋巴组织的研究进展

水产学报 2024年第4期48卷 22-31页

作者：绳秀珍王锦诚唐小千邢婧迟恒战文斌中国海洋大学水产动物病害与免疫学实验室海水养殖教育部重点实验室

鱼类黏膜相关淋巴组织是抵御病原入侵的第一道防线。其中，鱼类鼻黏膜相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)近年来被国内外学者所关注，并被证明是嗅觉器官中抗原识别和启动黏膜免疫应答的重要场所，在细菌、病毒和寄... 详细信息

鱼类黏膜相关淋巴组织是抵御病原入侵的第一道防线。其中，鱼类鼻黏膜相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)近年来被国内外学者所关注，并被证明是嗅觉器官中抗原识别和启动黏膜免疫应答的重要场所，在细菌、病毒和寄生虫感染后可发挥快速的局部免疫响应。以NALT为靶点，对鱼类开展疫苗鼻内接种可起到良好的免疫保护效果。但目前，对NALT中复杂的免疫细胞与分子网络及其互作机制知之甚少。本文对鱼类嗅觉器官结构与功能、NALT的细胞与分子网络及免疫应答、鼻内接种的应答及免疫保护效果等方面的最新研究进展进行综述，旨在阐明鱼类NALT在黏膜局部发挥的免疫防御机制，以期为新型黏膜疫苗的设计与研发提供参考。

关键词：鱼类鼻黏膜相关淋巴组织(NALT) 黏膜免疫嗅觉器官鼻内接种疫苗

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

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渔业科学进展 2024年第1期45卷 211-223页

作者：郑玉东张翔姚梦丽谷莉黄博闻辛鲁生白昌明王崇明唐小千中国海洋大学水产动物病害与免疫学实验室山东青岛266003 中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌... 详细信息

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析,结果显示,12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing,ST)分型互不相同,7株为Pub MLST数据库已经收录的ST型,5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因,但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征,对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点;不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异,对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。

关键词：溶藻弧菌 MLST 毒力基因耐药性分析

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沙蚕中弧菌种类、载量及杀菌药物作用效果

中国水产科学 2024年第6期31卷 731-743页

作者：苟紫玥王秀华杨冰朱欣洁席瑞潘明超胡希立上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

为查清饵料沙蚕中弧菌病原携带情况,建立有效病原消除技术,本研究调查了我国沿海10个区域养殖及野生沙蚕中弧菌病原种类及载量,用柠檬酸、聚维酮碘、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、苹果酸、甲酸、二甲酸钾、丙酸及弧菌净（含柠檬酸与酸性硫酸... 详细信息

为查清饵料沙蚕中弧菌病原携带情况,建立有效病原消除技术,本研究调查了我国沿海10个区域养殖及野生沙蚕中弧菌病原种类及载量,用柠檬酸、聚维酮碘、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、苹果酸、甲酸、二甲酸钾、丙酸及弧菌净（含柠檬酸与酸性硫酸钙商用产品）为杀菌药物,测试了其对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的体外杀菌效果;以最低体外杀菌浓度的柠檬酸、聚维酮碘及弧菌净杀菌药物浸泡沙蚕,测试了其对蚕体内弧菌的消除效果,并研究了其对沙蚕的安全浓度,同时分析了3种药物浸泡沙蚕3 h后,沙蚕体内蛋白、脂肪、胆固醇及维生素E含量变化。结果表明,样品沙蚕中携带溶藻弧菌、哈维氏弧菌（V. harveyi）、欧文氏弧菌（V. owensii）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）及嗜芳香环弧菌（V. cyclitrophicus）,检出率分别为86.7%、20.0%、13.3%、13.3%及6.7%。样品中弧菌载量最高达到7.0×10～4 cfu/g,最低载量为2.0×10～3 cfu/g。9种药物体外最低杀菌浓度由低到高依次为聚维酮碘(10.0×10-3g/L)、甲酸（0.5g/L）、弧菌净（1.0g/L）、柠檬酸/苹果酸/丙酸（1.2g/L）、二甲酸钾（1.6g/L）、脱氢乙酸钠（12.0 g/L）,山梨酸钾（30.0g/L）。用柠檬酸、聚维酮碘及弧菌净最低有效浓度溶液浸泡沙蚕0.5h与3h,体内弧菌杀菌率分别为96.2%、66.4%、99.9%与97.7%、98.0%、100.0%。3种药物对沙蚕的安全浓度分别为48.9×10-3g/L、120.3×10-3g/L、963.0×10-3g/L。经过3种消毒剂处理后,沙蚕体内的蛋白、脂肪、胆固醇及维生素E的含量与对照组比均有显著的降低（P研究结果可为对虾疾病综合防控提供技术支撑。

关键词：沙蚕弧菌有机酸聚维酮碘杀菌浓度安全浓度营养成分

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因缺失株构建及其生物学特性研究

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渔业科学进展 2024年第3期45卷 182-192页

作者：刘定远王春元于永翔王印庚李京泽张晓松秦蕾张正江苏海洋大学江苏连云港222005 中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业农村部海水养殖病害防治重点实验室山东青岛266071

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae ***,PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λ... 详细信息

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae ***,PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm,比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products,ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物,通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。结果显示,毒力基因dly缺失后导致PDD菌株生长变慢,涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低;野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化;与野生株相比,缺失株的生物被膜形成能力有显著差异(P实验表明,缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性,并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。

关键词：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种缺失株胞外产物生物学特性致病性

植物乳杆菌对许氏平鲉生长、免疫功能、消化能力及肠道菌群结构的影响

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广东海洋大学学报 2024年第3期44卷 42-54页

作者：樊英麻丹萍李莉姜景腾王友红王淑娴侯富晟叶海斌刘虹华岳新璐山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心)/山东省海水养殖病害防治重点实验室山东青岛266104 威海市海洋发展研究院山东威海264200 威海圣航海洋科技有限公司山东威海264200

【目的】分析植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP37)对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)生长、免疫功能、消化能力及肠道菌群结构的影响。【方法】实验选取初始体质量为(32.23±9.38)g的许氏平鲉1200尾,随机分为4组,记为对照组、LP37... 详细信息

【目的】分析植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LP37)对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)生长、免疫功能、消化能力及肠道菌群结构的影响。【方法】实验选取初始体质量为(32.23±9.38)g的许氏平鲉1200尾,随机分为4组,记为对照组、LP37实验组、FF实验组、FF-LP37实验组,实验周期为45 d;其中对照组投喂基础饲料,LP37实验组在基础饲料中添加107 CFU/g LP37,FF实验组添加20 mg/kg氟苯尼考(Florfenicol,FF),FF-LP37实验组于1~15 d添加20 mg/kg FF,16~30 d添加107 CFU/g LP37;实验30 d采集各组鱼血清、肝脏、肠道内容物,分析生长性能、消化酶活性、免疫功能、肠道菌群结构。【结果】(1)与对照组比较,各实验组许氏平鲉增重率和特定生长率均显著提高(P实验组效果最好;各实验组血清蛋白酶(PPS)和α-淀粉酶(AMS)活性均显著提高(P实验组和FF-LP37实验组差异显著(P实验组差异显著(P实验组血清和肝脏中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著降低(P实验组AST活性降低但ALT活性升高,AKP和SOD活性无显著差异(P>0.05),而MDA含量增加(P实验组ALT和AST活性均显著降低(P0.05)。(3)微生物高通量测序结果显示,与对照组比较,FF-LP37实验组肠道菌群多样性、丰富度和OTU数量最高,FF实验组肠道菌群敏感性升高;LP37实验组变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度增多,乳杆菌属、乳球菌属相对丰度显著增加;FF实验组厚壁菌门相对丰度增多,但乳杆菌属相对丰度降低;FF-LP37实验组变形菌门相对丰度增加,但乳杆菌属相对丰度增加;各实验组假单胞菌属和弧菌属相对丰度均呈现降低现象;这些均与Bugbase预测分析结果相呼应。(4)功能预测分析表明,LP37和FF对许氏平鲉肠道菌群功能未产生显著影响,菌群功能集中表现在代谢方面。【结论】LP37对许氏平鲉养殖具有益生作用,LP37可发挥正向调控促进鱼体健康。

关键词：许氏平鲉植物乳杆菌消化免疫肠道菌群

FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

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渔业科学进展 2024年第3期45卷 193-202页

作者：连新宇王秀华李晨张庆利苟紫玥吕若萱杨冰浙江海洋大学水产学院浙江舟山316022 中国水产科学研究院黄海水产研究所、青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室、农业农村部海水养殖病害防治重点实验室、青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA(flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE(Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50μL TE缓冲液于95℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103copies/μL以上,室温(20~25℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、虾十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus,CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。

关键词： IHHNV FTA卡洗脱方法优化

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美洲鲥鱼嗜水气单胞菌病原的分离与鉴定

渔业科学进展 2024年第2期45卷 257-266页

作者：王会林晋怀远高晔夏苏东李杰天津农学院水产学院天津300384 中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室山东青岛266071

2021年,山东省临沂市一养殖场养殖的美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)突发疾病并出现严重死亡,日死亡率高峰期达到2.5%,累积死亡率约为90%。患病鱼主要症状为体表出血、溃疡,解剖可见腹腔腹水、肝脏暗红,并伴有肠炎。组织病理学检测发现,病... 详细信息

2021年,山东省临沂市一养殖场养殖的美洲鲥鱼(Alosa sapidissima)突发疾病并出现严重死亡,日死亡率高峰期达到2.5%,累积死亡率约为90%。患病鱼主要症状为体表出血、溃疡,解剖可见腹腔腹水、肝脏暗红,并伴有肠炎。组织病理学检测发现,病鱼肝脏出现弥散性坏死,嗜碱性粒细胞增多和细胞肿胀空泡变性;脾脏出现出血性贫血性坏死灶、核破裂和核固缩;肾脏淋巴细胞坏死脱落,肾小体毛细血管球萎缩,近端小管和远端小管内的细胞出现不同程度的细胞结构消失。发病鱼肉眼和显微镜观察未见明显寄生虫,利用PCR方法检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2)、鲈鱼蛙病毒(largemouth bass ranavirus)等淡水鱼类常见病毒均为阴性。细菌分离培养结果显示,从发病鱼的肝脏、肾脏和脾脏中分离得到形态一致的优势菌,命名为AS-AH2101。经16S rRNA测序比对和生理生化鉴定,确定AS-AH2101为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。毒力基因检测结果显示,AS-AH2101携带气溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、丝氨酸蛋白酶(ahpA)、热稳定细胞肠毒素(ast)、热敏感细胞肠毒素(altA)和密度感应系统(luxS)基因。人工感染实验结果显示,AS-AH2101能引起蓝曼龙(Trichogaster trichopterus)发病死亡,半数致死量为3.23×10^(4)CFU/尾。药物敏感性研究表明,AS-AH2101对头孢拉啶、阿莫西林、氨苄西林和红霉素等4种抗生素具有耐药性,对四环素和多西环素等11种抗生素敏感。综上所述,本研究报道了我国养殖美洲鲥鱼感染嗜水气单胞菌的典型病例,为美洲鲥鱼在我国养殖过程中的疾病防控以及嗜水气单胞菌病的防治提供了参考和借鉴。

关键词：美洲鲥鱼嗜水气单胞菌细菌鉴定毒力基因

适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

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渔业科学进展 2024年第4期45卷 166-174页

作者：姚梦丽白昌明王崇明辛鲁生中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071 广西农产资源化学与生物技术重点实验室广西玉林537000 中国海洋大学水产学院山东青岛266003

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流... 详细信息

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。

关键词：核酸释放剂重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试纸条(LFD) 虾肝胰腺病原快速检测

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opaR基因缺失对AHPND致病菌生物学特性及毒力质粒接合转移的影响

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渔业科学进展 2024年第4期45卷 155-165页

作者：王利莹董宣王国浩王德浩谢景媚罗婧斐王显伟黄倢上海海洋大学水产与生命学院上海201306 海水养殖育种与可持续产出全国重点实验室(中国水产科学研究院黄海水产研究所)青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071 天津农学院水产学院天津300392 山东大学生命科学学院山东青岛266237 亚太水产养殖中心网泰国曼谷10900

急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现,致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system, T4SS)可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接... 详细信息

急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)严重影响了我国乃至全球对虾养殖业的发展。近期研究发现,致病菌毒力质粒携带trb型Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system, T4SS)可在高菌体密度下介导毒力质粒发生接合转移,从而导致AHPND致病菌多样性。为探究群体感应与T4SS表达以及毒力质粒接合转移的关系,本研究以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)群体感应系统的高密度调控子OpaR为研究对象,在致AHPND副溶血弧菌20130629002S01::cat(Vp2S01::cat)菌株基础上,利用同源重组技术构建opaR基因缺失株Vp2S01::catΔopaR。比较了出发菌株和缺失株在生长性能、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异,分析了opaR基因对T4SS基因表达量以及质粒接合转移效率的影响。结果显示,opaR基因缺失不影响细菌的生长特性和群集运动,但泳动能力显著增加,生物被膜形成能力显著下降;接合转移实验显示,opaR基因缺失显著提高T4SS表达水平和接合转移效率。本研究为解析群体感应系统调控AHPND致病菌T4SS表达以及毒力质粒接合转移机制提供了基础数据,可为控制AHPND致病菌毒力质粒传播提供技术支撑。

关键词：副溶血弧菌 opaR基因生物学特性 Ⅳ型分泌系统水平转移