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系统代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌CP提高L-亮氨酸生产

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食品与发酵工业 2024年

作者：吴开水刘韪玮马零徐庆阳江苏元易邦生物科技有限公司天津科技大学生物工程学院

L-亮氨酸是一种重要的支链氨基酸，在医药、食品、饲料、化妆品等多领域中具有重要价值。目前，工业上用于生产L-亮氨酸的菌株存在转化率低、副产物多、结晶后产率大幅下降等问题。为获得一株性能优越的L-亮氨酸生产菌株，该研究对L-亮... 详细信息

L-亮氨酸是一种重要的支链氨基酸，在医药、食品、饲料、化妆品等多领域中具有重要价值。目前，工业上用于生产L-亮氨酸的菌株存在转化率低、副产物多、结晶后产率大幅下降等问题。为获得一株性能优越的L-亮氨酸生产菌株，该研究对L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌CP进行系统代谢工程改造，首先，敲除竞争途径并引入外源磷酸酮醇酶（由fxpk编码）加强前体物（丙酮酸和乙酰CoA）供应；其次，加强主代谢流（亮氨酸途径和支链氨基酸共同途径）提高L-亮氨酸产量；随后，加强胞内NADPH的供应；最后，敲除L-亮氨酸内转运蛋白BrnQ，最终获得的可高效生产L-亮氨酸的工程菌株CP06-1在5 L生物反应器中经50 h发酵后L-亮氨酸产量达65.3 g/L，糖酸转化率25.1%。此外，为解决L-亮氨酸结晶后产生的泡沫影响菌体吸收营养和溶氧的问题，该研究采取了半连续发酵的方式在L-亮氨酸结晶前通过放液-补液来延长菌株产酸高峰期，最终5 L生物反应器发酵50 h总生产L-亮氨酸228.8 g，糖酸转化率达27.9%，较分批补料提高了11.2%。该研究为L-亮氨酸生产菌株的改造和应用提供了一定的指导价值。

关键词： L-亮氨酸系统代谢工程谷氨酸棒状杆菌乙酰CoA NADPH 半连续发酵

实验动物三种条件致病菌多重分子检测方法的建立

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实验动物科学 2024年第4期41卷 61-67页

作者：蔡利东田苗苗李乃馨王馨宇杨慧欣江苏集萃药康生物科技股份有限公司南京210061

目的建立金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌三种条件性致病菌的多重荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法选取金黄色葡萄球菌nuc基因、肺炎克雷伯杆菌phoE基因、绿脓假单胞菌gyrB基因设计特异性引物及探针,建立多重qPCR方法,并... 详细信息

目的建立金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌三种条件性致病菌的多重荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法选取金黄色葡萄球菌nuc基因、肺炎克雷伯杆菌phoE基因、绿脓假单胞菌gyrB基因设计特异性引物及探针,建立多重qPCR方法,并测试其特异性、灵敏度、标准曲线及重复性等性能指标。用该方法检测30个临床粪便样品、6个阳性参考品,检测结果与分离培养法结果进行对比,计算符合率。结果多重qPCR检测方法对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌的标准菌株基因组DNA均能稳定检出;对鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、鼠棒状杆菌、支气管鲍特杆菌等病原微生物项目无非特异性扩增;针对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌标准菌株基因组DNA的灵敏度分别为1.0×10^(-5)、1.0×10^(-4)、1.0×10^(-5)ng/μL;批间差异、批内差异均小于2%,重复性良好;临床样品和阳性参考品的检测结果显示多重qPCR法与分离培养法的检测结果一致。结论本研究成功建立了一种可同时、快速检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌的多重qPCR检测方法。

关键词：多重荧光定量PCR方法培养法条件致病菌

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利用酵母细胞工厂合成丁二酸的研究进展

生物工程学报 2024年第8期40卷 2644-2665页

作者：钟驭涛尚长宇王言东李建华刘成才崔志勇祁庆生山东大学微生物技术国家重点实验室山东青岛266237 齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司黑龙江齐齐哈尔161031

丁二酸(又称琥珀酸)是一种重要的C4平台化合物,可作为1,4-丁二醇、四氢呋喃以及生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)的生产原料。与传统的以顺酐为原料的石化基路线相比,采用微生物发酵法生产丁二酸不仅具有更... 详细信息

丁二酸(又称琥珀酸)是一种重要的C4平台化合物,可作为1,4-丁二醇、四氢呋喃以及生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)的生产原料。与传统的以顺酐为原料的石化基路线相比,采用微生物发酵法生产丁二酸不仅具有更高的经济可持续性,同时也展现出更佳的环境友好性。酵母具有良好的耐酸性,能够实现丁二酸的低pH发酵,从而大幅降低产物提取成本。因此,通过代谢工程改造构建高产丁二酸酵母菌株受到越来越多的关注。本文系统介绍了丁二酸的应用价值及其市场规模,总结了微生物中参与丁二酸合成的途径及其关键酶,详细阐述了利用酵母细胞工厂合成丁二酸的最新研究进展,同时还展示了酵母工程菌株以甘油、乙酸、木质纤维素水解液等非粮原料为底物进行丁二酸合成的现状,最后对基于酵母细胞工厂的低pH丁二酸生物制造进行了展望。

关键词：丁二酸酵母代谢工程细胞工厂低pH生物制造

腐植酸悬浮剂对NaCl胁迫下小麦种子萌发和幼苗生长的影响

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作物杂志 2024年第4期 263-268页

作者：张子怡王学虎苑莹沈志峰河北萌帮生物科技有限公司研发部河北邢台054300

不同分子量的腐植酸具有不同的功能特性。本试验研究不同分子量腐植酸对NaCl胁迫下小麦幼苗生长的影响,以促进腐植酸资源合理开发利用。采用双层滤纸培养法,设置5个处理,分别为清水(T1)、200 mmol/LNaCl溶液(T2)、T2+腐植酸悬浮剂Ⅰ(大... 详细信息

不同分子量的腐植酸具有不同的功能特性。本试验研究不同分子量腐植酸对NaCl胁迫下小麦幼苗生长的影响,以促进腐植酸资源合理开发利用。采用双层滤纸培养法,设置5个处理,分别为清水(T1)、200 mmol/LNaCl溶液(T2)、T2+腐植酸悬浮剂Ⅰ(大分子量,T3)、T2+腐植酸悬浮剂Ⅱ(中等分子量,T4)、T2+腐植酸悬浮剂Ⅲ(小分子量,T5)。结果表明,与T2处理相比,添加腐植酸均可显著降低小麦根部相对电导率,提高小麦发芽率、根长、株高、可溶性糖含量、总叶绿素含量以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性。上述指标在T3处理下分别提高17.81%、68.46%、90.63%、21.37%、19.88%、61.07%、14.59%、30.70%,T4处理下分别提高了20.12%、101.80%、80.21%、33.42%、23.39%、62.19%、39.43%、46.73%,T5处理则分别提高了21.26%、166.67%、54.17%、35.73%、24.56%、63.43%、43.60%、48.22%。综合分析表明,不同分子量腐植酸均可提高小麦的萌发率以及幼苗的抗盐能力。其中,大分子量腐植酸促进小麦叶片生长效果显著,小分子量腐植酸在促进小麦根系生长、提高植物体内抗氧化酶活性以及增强细胞膜稳定性等方面发挥了重要的作用。

关键词：小麦不同分子量腐植酸 NaCl胁迫种子萌发幼苗生长特性抗氧化酶

椰糠栽培条件下‘云烟87’种子产质量变化及生长模型构建

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分子植物育种 2024年

作者：潘磊毛春堂吴家昶陈云松潘义宏张立猛玉溪中烟种子有限责任公司云南五佳生物科技有限公司

为构建智能化烟草繁种技术体系，本研究以‘云烟87’为研究对象，在温室无土栽培条件下，对比分析椰糠作为栽培基质对‘云烟87’产质量的影响，探索研究其对应的繁种生长模型。通过对农艺性状和种子产质量的数据分析，椰糠处理不仅在农... 详细信息

为构建智能化烟草繁种技术体系，本研究以‘云烟87’为研究对象，在温室无土栽培条件下，对比分析椰糠作为栽培基质对‘云烟87’产质量的影响，探索研究其对应的繁种生长模型。通过对农艺性状和种子产质量的数据分析，椰糠处理不仅在农艺性状方面优于土壤处理，而且椰糠处理还大幅增加了烟株的单株果数和单株种子产量，两次试验较土壤分别提高了91.73%、48.42%和115.90%、94.23%，并且种子质量也优于土壤处理；利用Pearson方法分析了大气温度、大气湿度和移栽时间与椰糠栽培条件下‘云烟87’生长指标之间的相关性，基于梯度下降回归算法构建了株高增量、最大叶长增量、最大叶宽增量和有效叶片数增量的回归模型，株高增量模型的R2=0.89，最大叶长增量模型的R2=0.82，最大叶宽增量模型的R2=0.97，有效叶片数增量模型的R2=0.95，模型精度高，预测结果接近样本均值。模型不仅阐述了大气温度、大气湿度与椰糠栽培条件下‘云烟87’生长之间的关系，而且可以根据‘云烟87’生长状况，合理给出温度和湿度的调节方案，为烤烟温湿度控制提供理论依据。

关键词：椰糠云烟87 种子增长量梯度下降算法生长模型

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无菌鼠细菌检测方法的选择与探讨

实验动物科学 2024年第1期41卷 51-57页

作者：韩磊蔡利东李灵恩吴东王馨宇熊艳杨慧欣江苏集萃药康生物科技股份有限公司南京210061

目的比较培养法、革兰染色镜检法和16S rRNA PCR方法对无菌小鼠粪便样品细菌检测的检测性能,为无菌鼠细菌检测方法的选择提供依据。方法利用培养法、革兰染色镜检法、16S rRNA PCR方法,分别检测GF小鼠粪便、SPF小鼠粪便以及已知含菌... 详细信息

目的比较培养法、革兰染色镜检法和16S rRNA PCR方法对无菌小鼠粪便样品细菌检测的检测性能,为无菌鼠细菌检测方法的选择提供依据。方法利用培养法、革兰染色镜检法、16S rRNA PCR方法,分别检测GF小鼠粪便、SPF小鼠粪便以及已知含菌量的测试样品(无菌小鼠粪便与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌混合,人为制作而成),验证3种方法对无菌小鼠粪便中细菌的检测限度;并同时使用3种方法检测临床样品,对比3种检测方法的优缺点,分析3种方法在实际检测中的可行性。结果培养法、革兰染色镜检法和16S rRNA PCR方法检测灵敏度分别为102CFU/g、108CFU/g和106CFU/g,临床样品检测中阳性率均为1.36%(6/441)。结论培养法、革兰染色镜检法、16S rRNA PCR法3种检测方法各有优缺点,需要联合使用,取长补短,确保检测结果的可靠。

关键词：无菌小鼠细菌检测培养法 PCR 革兰染色镜检

无土栽培基质中氮、钾施用量对微生物群落结构的影响分析

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分子植物育种 2024年

作者：潘磊毛春堂吴家昶陈云松潘义宏张立猛云南五佳生物科技有限公司玉溪中烟种子有限责任公司

为明确烟草无土栽培繁种基质中微生物群落的动态变化及不同时期适宜的氮钾施用量，本研究以‘云烟87’为材料，以椰糠为栽培基质，通过宏基因组学方法，研究‘云烟87’在不同氮钾梯度下椰糠中微生物群落在团棵期和种子采收期的动态变化... 详细信息

为明确烟草无土栽培繁种基质中微生物群落的动态变化及不同时期适宜的氮钾施用量，本研究以‘云烟87’为材料，以椰糠为栽培基质，通过宏基因组学方法，研究‘云烟87’在不同氮钾梯度下椰糠中微生物群落在团棵期和种子采收期的动态变化。通过分析发现，在团棵期和采收期各检出14个菌门，24个菌属，优势菌门中变形菌门Proteobacteria相对丰度最高，其次是放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes；优势菌属为根瘤菌属Rhizobium、不粘杆菌属Asticcacaulis、德沃氏菌属Devosia、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和Pseudolabrys，根瘤菌属Rhizobium相对丰度在各处理中均最高；移栽期至团棵期1-F4处理(25%氮钾施用量)和盛花期至采收期3-F2处理(25%氮钾总量)的氮钾浓度提高了基质中微生物的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢基因丰度，有利于提升基质中微生物alpha多样性。

关键词：烟草繁种无土栽培宏基因组微生物群落多样性

树灵芝(Ganoderma sessile， SCAU-My1)菌丝体液态发酵条件优化以及菌丝体复合材料制备

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食品与发酵工业 2024年

作者：钟梓杰李雪玲胡文锋杨美艳深圳循环生物科技有限公司华南农业大学食品学院

该研究以树灵芝(Ganoderma sessile，SCAU-My1)为发酵菌株，采用菌丝体液态发酵制备种子，参考食用菌栽培技术进行菌丝体复合材料(mycelium-base composites，MBCs)制备。分别以麻秆和玉米秸秆为主要原料，接种上述菌丝体液态种后，固... 详细信息

该研究以树灵芝(Ganoderma sessile，SCAU-My1)为发酵菌株，采用菌丝体液态发酵制备种子，参考食用菌栽培技术进行菌丝体复合材料(mycelium-base composites，MBCs)制备。分别以麻秆和玉米秸秆为主要原料，接种上述菌丝体液态种后，固态发酵培养5 d，从而制备可生物降解的MBCs。首先，对树灵芝的菌丝体液态发酵种子培养基及培养条件进行了优化，研究碳源、氮源、发酵温度等因素对菌丝体生物量的影响。结果表明，最佳制种培养基配方为玉米淀粉25 g/L、黄豆粉14 g/L、KH2PO43 g/L、7H2O·MgSO43 g/L；最佳培养条件为发酵温度28 ℃，初始pH 5.5，接种量5%，装瓶量150 mL/500 mL，转速为180 r/min。在此条件下，种子液菌丝体生物量达18.73 g/L，较优化前的13.90 g/L，提高了34.7%。制备的MBCs在形变发生50%时，玉米秸秆-菌丝体复合材料(C-MBCs)压缩应力为聚乙烯(EPS)材料的5.4倍，为麻秆-菌丝体复合材料(H-MBCs)的0.6倍；在热重分析中，经过600 ℃热处理C-MBCs质量剩余约39%，H-MBCs质量剩余约33%，而EPS材料仅剩1.08%，说明玉米秸秆或麻秆制成的MBCs承重能力、热稳定性均优于EPS材料。此结果为菌丝体复合材料替代发泡塑料作为缓冲包装材料提供有意义的参考。

关键词：树灵芝菌丝体培养基优化发酵条件优化菌丝体复合材料可生物降解

灰葡萄孢菌BcGLS基因的克隆、生物信息学分析及逆境胁迫下转录表达分析

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食品与发酵工业 2024年第18期50卷 169-176,I0001,I0002页

作者：孟利娟昝新艺杨雨蒙张子盈崔凤杰田贞乐江苏大学食品与生物工程学院江苏镇江212013 江苏安惠生物科技有限公司江苏南通226009

β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)催化合成的细胞壁核心组分β-1,3-葡聚糖对真菌的生存和毒力至关重要,该酶是研发抗菌药物的重要作用靶点。为了了解β-1,3-葡聚糖合成酶基因(BcGLS)在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的功能... 详细信息

β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)催化合成的细胞壁核心组分β-1,3-葡聚糖对真菌的生存和毒力至关重要,该酶是研发抗菌药物的重要作用靶点。为了了解β-1,3-葡聚糖合成酶基因(BcGLS)在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的功能,该研究通过克隆获得BcGLS全长序列,序列全长7137 bp,编码1932个氨基酸,生物信息学分析结果显示,其编码蛋白(BcGLSp)理论相对分子质量为220.05 kDa,理论等电点为7.97;亚细胞预测其定位于细胞膜,存在17个跨膜结构,不存在信号肽,为非分泌蛋白;含有176个磷酸化位点,为亲水性蛋白。保守结构域分析结果表明,BcGLSp含有一个β-1,3-葡聚糖合成酶结构域和一个β-1,3-葡聚糖合成酶亚基FKS1,属于葡聚糖合成酶超家族。系统进化分析表明,灰葡萄孢菌BcGLS与植物致病菌如山茶叶杯菌、景天白粉菌等的葡聚糖合成酶亲缘关系近。不同逆境胁迫条件(氯化钠、十二烷基硫酸钠、过氧化氢)显著抑制灰葡萄孢菌菌丝生长,实时定量PCR进一步分析显示BcGLS在不同非生物胁迫条件下均上调表达,表明BcGLS基因的转录表达与环境压力密切相关。该研究为深入探讨BcGLS在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的基因功能和灰葡萄孢菌的新型防治策略提供理论材料和实践依据。

关键词：灰葡萄孢菌 BcGLS 生物信息学逆境胁迫转录表达

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