检索结果-南通市图书馆

分子体积排阻高效液相色谱法测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物的浓度

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药物分析杂志 2020年第8期40卷 1365-1370页

作者：廉开礼崔岩彭伟曹宇刘忠张贵民赵丽丽山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室临沂273400

目的:建立定量测定溶剂中低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm,5μm)体积排阻色谱柱,高效液相紫外检测器在214 nm处测定抗体药物吸收... 详细信息

目的:建立定量测定溶剂中低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm,5μm)体积排阻色谱柱,高效液相紫外检测器在214 nm处测定抗体药物吸收度。对SEC-HPLC法进行专属性、系统残留、线性、精密度、稳定性方法学验证,并使用该方法和紫外-可见分光光度法测定样品浓度,进行准确度分析。结果:SEC-HPLC法对抗体药物浓度的测定无干扰;在0.01~0.32 mg·mL^-1浓度范围内,SECHPLC法线性良好(相关系数R2=1.000);不同实验者不同时间使用该方法可准确测定抗体药物浓度,RSD均≤2.0%,回收率均处于90.0%~110.0%之间;-80℃反复冻融和2~8℃存放24 h后,SEC-HPLC法仍能准确测定抗体药物浓度,稳定性良好(RSD≤2.0%)。SEC-HPLC法能准确测定样品浓度,RSD≤2.0%,回收率均处于90.0%~110.0%之间,而紫外-可见分光光度法不能准确测定低浓度(0.01 mg·m L^-1)样品的浓度,RSD为5.7%,回收率为131.6%。结论:SEC-HPLC测定浓度法准确性和精密度良好,能准确测定溶媒剂中0.01~0.32 mg·mL^-1范围内抗体药物浓度,能避免紫外-可见分光光度法测定0.01 mg·mL^-1样品不准确的局限性,可作为测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的有效方法之一。

关键词：分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC) 紫外-可见分光光度法抗体药物方法验证浓度

抗程序性死亡受体1单克隆抗体体外细胞因子释放综合征风险评估

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药物评价研究 2019年第8期42卷 1520-1522页

作者：彭伟刘忠张贵民赵丽丽山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室

目的选择合适的方法评价抗程序性死亡受体1(PD-1)单克隆抗体在体外引起细胞因子释放的风险。方法通过抗体与人PBMC细胞共培养6、24 h,并用流式技术评估重组人源化抗PD-1单克隆抗体(F520)和已上市抗PD-1单克隆抗体Opdivo、Keytruda是否... 详细信息

目的选择合适的方法评价抗程序性死亡受体1(PD-1)单克隆抗体在体外引起细胞因子释放的风险。方法通过抗体与人PBMC细胞共培养6、24 h,并用流式技术评估重组人源化抗PD-1单克隆抗体(F520)和已上市抗PD-1单克隆抗体Opdivo、Keytruda是否存在引起细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)的风险。结果成功建立了采用人PBMC细胞在体外进行抗PD-1单克隆抗体细胞因子释放的评价技术。结论与人PBMC细胞的共培养6、24 h,F520、Opdivo和Keytruda在体外均不存在引起CRS的风险。

关键词：抗PD-1单克隆抗体 F520 细胞因子释放综合征

一种基于等P/V策略的生物反应器缩小模型的建立

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 868-872页

作者：赵丽丽朱玉强马动张贵民刘忠山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400

目的应用3 L生物反应器,基于等P/V策略建立生产规模450 L生物反应器的缩小模型。方法应用3 L生物反应器,按照生产工艺培养稳定表达抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞,培养16 d应用亲和层析纯化抗CD20单克隆抗体,分子排阻法分析抗体聚体... 详细信息

目的应用3 L生物反应器,基于等P/V策略建立生产规模450 L生物反应器的缩小模型。方法应用3 L生物反应器,按照生产工艺培养稳定表达抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞,培养16 d应用亲和层析纯化抗CD20单克隆抗体,分子排阻法分析抗体聚体,弱阳离子高效液相色谱法分析抗体的酸性峰和碱性峰含量,2-AB标记法检测抗体糖型含量,mini-tab软件对结果进行双单侧检验(Two One-Sided Test,TOST)分析。结果与生产规模相比,缩小规模细胞生长、二氧化碳分压(pCO_(2))水平及主要代谢产物乳酸和铵离子水平基本一致,抗体表达量、聚体含量、糖型结果及酸性峰和碱性峰含量经分析,均具有等价性。结论基于等P/V缩小原则成功建立了生产规模生物反应器的缩小模型。

关键词：等P/V 生物反应器缩小模型 CHO细胞

杜拉鲁肽类似药(27C7)的蛋白表达及理化性质分析

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药物评价研究 2020年第2期43卷 237-241页

作者：赵丽丽谢艺嘉王玲玲朱中松张贵民刘忠山东新时代药业哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400

目的真核表达杜拉鲁肽类似药胰高糖素样肽l(GLP-1)-Fc融合蛋白(27C7),并与杜拉鲁肽进行理化性质比较。方法构建真核表达载体pCHO1.0-GLP-1-Fc,并用脂质体转染CHO细胞,经甲氨蝶呤和嘌呤霉素加压筛选,再单克隆筛选,得到1株高表达的细胞模... 详细信息

目的真核表达杜拉鲁肽类似药胰高糖素样肽l(GLP-1)-Fc融合蛋白(27C7),并与杜拉鲁肽进行理化性质比较。方法构建真核表达载体pCHO1.0-GLP-1-Fc,并用脂质体转染CHO细胞,经甲氨蝶呤和嘌呤霉素加压筛选,再单克隆筛选,得到1株高表达的细胞模型。采用Protein A亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测蛋白大小,质谱仪进行高分辨分子量检测,高效液相色谱法检测蛋白纯度,毛细管等点聚焦电泳(CIEF)检测蛋白等电点,细胞活性功能评价杜拉鲁肽与27C7生物活性的一致性。结果通过SDS-PAGE、样品高分辨分子量检测,27C7与杜拉鲁肽分子量一致;分子排阻色谱检测27C7与杜拉鲁肽单体纯度接近,CIEF显示27C7与杜拉鲁肽的等电点一致;体外活性检测结果表明,27C7与杜拉鲁肽的生物学活性一致。结论类似药27C7与杜拉鲁肽具有一定的一致性,可进行下一步的类似药研发工作。

关键词：胰高血糖素样肽-1 中国仓鼠卵巢细胞理化性质杜拉鲁肽

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鼠源抗CD47单克隆抗体的筛选及活性评价

中国医药工业杂志 2022年第5期53卷 672-678页

作者：朱中松赵丽丽张贵民曹宇刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

通过杂交瘤技术筛选得到了一株鼠源抗白细胞分化抗原47(CD47)单克隆抗体。采用聚乙二醇融合法,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选抗CD47的杂交瘤细胞,通过Protein G亲和柱纯化抗体,利用十二烷基磺酸钠(SD... 详细信息

通过杂交瘤技术筛选得到了一株鼠源抗白细胞分化抗原47(CD47)单克隆抗体。采用聚乙二醇融合法,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选抗CD47的杂交瘤细胞,通过Protein G亲和柱纯化抗体,利用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法检测目的蛋白的相对分子质量,通过生物分子相互作用分析仪检测目的抗体的亲和力,并通过ELISA法测定抗CD47抗体的信号调节蛋白α(SIRPα)的阻断效力。用藻红蛋白(PE)标记的Raji细胞与不同浓度的抗CD47单抗共同孵育,检测抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬的作用。采用血凝试验对抗CD47单抗导致红细胞凝集的能力进行了分析,并进一步通过小鼠实体瘤模型,考察抗CD47单抗的抑制肿瘤生长作用。结果显示,筛选得到的一株杂交瘤细胞,即抗CD47单克隆抗体3D8,其亲和力常数值为1.29×10^(-11)mol/L,ELISA法测得其半数有效浓度(EC_(50))值为0.17 nmol/L,可有效阻断CD47与SIRPα的相互作用,增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力,吞噬率达85%。该抗体在亲和力、阻断力、吞噬率等方面均优于在售抗体,同时不会导致红细胞凝集。在小鼠实体瘤模型中,肿瘤生长抑制率为95.44%,可明显抑制肿瘤生长。本研究为后期抗CD47抗体的人源化和抗CD47抗体的临床前研究提供了参考。

关键词：抗CD47单克隆抗体杂交瘤技术亲和力红细胞凝集抗肿瘤活性

分子排阻色谱法测定德谷胰岛素高分子蛋白含量

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中国现代应用药学 2020年第23期37卷 2879-2882页

作者：杨庆马鲁南刘忠张贵民山东新时代药业有限公司山东省蛋白类药物工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂276006

目的建立德谷胰岛素高分子蛋白质的定量分析测定方法。方法采用Insulin HMWP色谱柱(7.8 mm×300 mm,10mm),以冰醋酸-异丙醇-水(4∶3∶10)为流动相,流速为0.5 mL·min^-1,检测波长为280 nm,利用分子排阻色谱法分离德谷胰岛素单体以及高... 详细信息

目的建立德谷胰岛素高分子蛋白质的定量分析测定方法。方法采用Insulin HMWP色谱柱(7.8 mm×300 mm,10mm),以冰醋酸-异丙醇-水(4∶3∶10)为流动相,流速为0.5 mL·min^-1,检测波长为280 nm,利用分子排阻色谱法分离德谷胰岛素单体以及高分子蛋白质,并对高分子蛋白质进行定量分析。结果该方法的检测限和定量限分别为0.18和0.47μg;仪器精密度RSD为0.51%,德谷胰岛素在0.125~4.0mg·mL^-1内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=20.864 1X-0.125 9,R^2=1.000 0;德谷胰岛素主峰与高分子蛋白质峰的分离度>2.0。结论建立的方法操作简便,灵敏度高,可有效地对德谷胰岛素高分子蛋白质进行定量分析。

关键词：德谷胰岛素高分子蛋白质分子排阻色谱法

联合酶解法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱检测重组水蛭素蛋白的二硫键结构

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中国医药工业杂志 2023年第11期54卷 1636-1645页

作者：徐金华赵丽丽柳常青张贵民刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 鲁南新时代生物技术有限公司山东临沂273400 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

采用联合酶切法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱解析重组水蛭素蛋白的复杂二硫键交联结构。首先从蛋白水平验证重组水蛭素蛋白是否含有游离半胱氨酸,包括高分辨质谱表征相对分子质量和定量检测游离巯基;然后利用单一酶解法标注每个或每组二硫... 详细信息

采用联合酶切法结合UPLC Q-TOF高分辨质谱解析重组水蛭素蛋白的复杂二硫键交联结构。首先从蛋白水平验证重组水蛭素蛋白是否含有游离半胱氨酸,包括高分辨质谱表征相对分子质量和定量检测游离巯基;然后利用单一酶解法标注每个或每组二硫键在蛋白序列中所处的位置;最后根据单酶所测结果,设计混合酶切的方式确定具体的二硫键配对方式,并利用二硫苏糖醇还原法加以验证,最终确证重组水蛭素蛋白的二硫键位置。结果显示,重组水蛭素蛋白存在10个半胱氨酸,共形成5对二硫键,分别为Ṩ1(Cys1-Cys2)、Ṩ2-Ṩ3(Cys3-Cys5/Cys4-Cys6或Cys3-Cys6/Cys4-Cys5)、Ṩ4(Cys7-Cys9)和Ṩ5(Cys8-Cys10)。

关键词： UPLC Q-TOF高分辨质谱二硫键蛋白类药物联合酶解

FGF21-Fc融合蛋白体外活性试验的建立和优化

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中国医药工业杂志 2023年第4期54卷 545-553页

作者：徐金华赵文鹏赵丽丽曹宇彭伟刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 沈阳药科大学辽宁沈阳110016 鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276000

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了... 详细信息

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了报告基因细胞,当FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho的结合,激活其FGF受体和诱导胞内信号转导所必需的共同受体,可通过检测萤光素酶活性,间接定量测定生物学活性。在建立过程中,分别对结合活性试验中样品和配体的浓度、供体和配体的稀释比例以及孵育时间进行优化,并进行了方法学验证,证明该HTRF技术具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白和β-Klotho的结合活性检测。随后,对生物学活性试验中胎牛血清的浓度、报告基因细胞的密度、试验板的类型以及细胞种板形式进行优化,并进行了方法学验证,证明该报告基因法具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白的生物学活性检测。本研究建立了FGF21-Fc融合蛋白的质控方法,为有同样活性检测难点的药物提供了一种分析技术参考,填补了国内外空白。

关键词：成纤维细胞生长因子-21 均相时间分辨荧光结合活性报告基因法生物学活性

CD47胞外区蛋白的真核表达与多克隆抗体的制备

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中国医药工业杂志 2019年第12期50卷 1439-1443页

作者：朱中松赵丽丽王玲玲张贵民刘忠山东新时代药业有限公司山东临沂273400 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室山东临沂273400 鲁南制药集团山东临沂276000

通过真核表达系统表达CD47胞外区融合蛋白,并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。构建CD47胞外区真核表达质粒pCHO1.0-CD47-mFc,转染CHO-S细胞,建立高效表达CD47胞外区融合蛋白的稳转细胞库,并表达CD47胞外区融合蛋白,通过protein G亲和色谱... 详细信息

通过真核表达系统表达CD47胞外区融合蛋白,并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。构建CD47胞外区真核表达质粒pCHO1.0-CD47-mFc,转染CHO-S细胞,建立高效表达CD47胞外区融合蛋白的稳转细胞库,并表达CD47胞外区融合蛋白,通过protein G亲和色谱法纯化,SDS-PAGE和Western Blot方法进行鉴定,Fortebio测定蛋白浓度。结果显示,获得的CHO-S-CD47-mFc细胞库的表达量在322 mg/L,纯化后蛋白纯度大于92%,表达的CD47-mFc融合蛋白可同CD47抗体特异性结合;将此CD47-mFc蛋白免疫新西兰兔,多克隆抗血清的效价达到1∶102400。

关键词：真核表达 CD47胞外区抗体细胞库