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CRISPR/Cas基因编辑和表达调控工具箱在放线菌中的应用

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生物工程学报 2025年

作者：丁金艳亓慧王猛张玥天津科技大学生物工程学院中国科学院天津工业生物技术研究所天津农学院食品科学与生物工程学院

放线菌是一类具有强大次级代谢能力的微生物，对放线菌菌株进行理性改造，对提升其天然产物的生产能力具有重要意义。CRISPR/Cas系统因具有高效性、易操作性和良好的靶向精确性，已成为放线菌基因改造和功能研究的重要工具。本文从工作... 详细信息

放线菌是一类具有强大次级代谢能力的微生物，对放线菌菌株进行理性改造，对提升其天然产物的生产能力具有重要意义。CRISPR/Cas系统因具有高效性、易操作性和良好的靶向精确性，已成为放线菌基因改造和功能研究的重要工具。本文从工作原理、系统构建、适用场景等角度对放线菌中的各类CRISPR/Cas基因编辑及表达调控工具进行了汇总和比较，包括基于DNA双链断裂的CRISPR/Cas系统，CRISPR干扰系统，CRISPR激活系统，以及CRISPR碱基编辑系统。同时，本文还总结了这些工具在放线菌天然产物生物合成方面的应用情况。CRISPR/Cas工具箱在放线菌中的开发和应用，极大地推动了放线菌微生物学和天然产物相关的研究。

关键词： CRISPR/Cas系统放线菌 CRISPR干扰 CRISPR激活碱基编辑

葡萄糖亚适量流加对谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的影响

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食品科学 2021年第20期42卷 30-37页

作者：熊海波刘景阳徐庆阳天津科技大学生物工程学院天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题。实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,... 详细信息

通过动态调节葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的供应速率,解决菌种在发酵产L-异亮氨酸不同时期对葡萄糖消耗能力差异的问题。实验结果表明,以谷氨酸棒杆菌YILM1504为供试菌株,在发酵初始葡萄糖添加量80 g/L、90%最大补糖速率的亚适量补糖工艺下,得到动态补糖速率为0(0~8h)、5.40~7.47(8~14 h)、7.47~7.00(16~24 h)、7.00~5.20 g/(L·h)(24~40 h),L-异亮氨酸达到44.32 g/L,糖酸转化率为19.63%。经代谢流对比分析发现,葡萄糖经戊糖磷酸途径和糖酵解途径代谢流之比为0.56,进入Ile的代谢流增强了18.92%,进入缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸的代谢流减弱了67.12%、72.21%、30.23%,该方法针对谷氨酸棒杆菌在细胞生长阶段与产酸阶段不同的耗糖能力,提供了精细的补糖速率策略,产酸高峰期明显延长,副产物积累比例得到降低,原料利用率大幅提升。

关键词： L-异亮氨酸葡萄糖亚适量谷氨酸棒杆菌代谢流

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

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现代食品科技 2014年第10期30卷 96-101页

作者：江衍哲张成林王志刚谢希贤徐庆阳陈宁天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨... 详细信息

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。

关键词：谷氨酰胺谷氨酸丙酮酸羧化酶谷氨酸棒杆菌 NCgl1221基因

增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响

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现代食品科技 2015年第10期31卷 109-114页

作者：周茜郑会明刘辉谢希贤徐庆阳张成林陈宁天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

L-苏氨酸是人类必需氨基酸,在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在L-苏氨酸发酵生产过程中,乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,构建了icl R基因缺失菌株THRD... 详细信息

L-苏氨酸是人类必需氨基酸,在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在L-苏氨酸发酵生产过程中,乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,构建了icl R基因缺失菌株THRDΔicl R以及不同强度启动子替换ace BAK启动子的菌株THRD P1和THRD P2。通过实时荧光定量PCR检测表明,苹果酸合酶基因(ace B)的表达量分别是原菌的1.89倍、2.11倍以及2.96倍。摇瓶发酵结果显示,THRDΔicl R的L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为42.60±1.23 g/L和32.77 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高20.61%和20.70%。THRD P1 L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为36.50±1.42 g/L和28.08 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高3.34%和3.39%。而THRD P2 8 h后菌体生长停滞,L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为8.31±1.31 g/L和20.78 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别降低了76.47%和23.52%。综上所述,适当增强乙醛酸循环有利于L-苏氨酸的积累,而过强的乙醛酸循环影响菌体的正常代谢。

关键词：大肠杆菌 L-苏氨酸回补乙醛酸循环启动子替换

嘌呤核苷磷酸化酶不同表达方式对发酵利巴韦林的影响

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现代食品科技 2015年第12期31卷 63-68,62页

作者：刘莉李燕军谢希贤陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pup G基因编码)是合成利巴韦林的关键酶,本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208发酵生产利巴韦林的影响。以*** TA208为出发菌株,分别利... 详细信息

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase,由pup G基因编码)是合成利巴韦林的关键酶,本研究考察该酶的质粒过表达和基因组整合表达对鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208发酵生产利巴韦林的影响。以*** TA208为出发菌株,分别利用基因过表达和无标记整合技术,成功构建了*** TA2081和TA2082。通过实时定量PCR测定这3株菌pup G基因的转录水平,结果表明与*** TA208相比,TA2081和TA2082的转录水平均有提高,但TA2081提高的更为显著;通过测定PNPase活性发现,*** TA2081和TA2082的PNPase活力分别为出发菌株TA208的2倍和1.30倍。7.5 L分批补料发酵实验表明,与出发菌*** TA208相比,工程菌TA2081鸟苷到利巴韦林的摩尔转化率从20.41%提高到98.63%,TA2082的转化率从20.41%提高到40.95%。综上所述,增加pup G的表达量能提高利巴韦林的产量,本研究为利巴韦林生产菌的代谢工程改造提供了理论依据和技术指导。

关键词：解淀粉芽孢杆菌利巴韦林嘌呤核苷磷酸化酶质粒过表达基因组整合表达

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生物素对L-缬氨酸发酵的影响

食品科学 2019年第22期40卷 213-218页

作者：徐达梅漫莉徐庆阳陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

为研究生物素添加量对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamate)发酵生产L-缬氨酸的影响,以谷氨酸棒状杆菌XV0505(Leu^-+Ile^-+2-TA^r+α-AB^r+SG^r)为供试菌株,考察不同生物素添加量条件下菌体量、耗糖、产酸以及副产物L-丙氨酸的情... 详细信息

为研究生物素添加量对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamate)发酵生产L-缬氨酸的影响,以谷氨酸棒状杆菌XV0505(Leu^-+Ile^-+2-TA^r+α-AB^r+SG^r)为供试菌株,考察不同生物素添加量条件下菌体量、耗糖、产酸以及副产物L-丙氨酸的情况,确定了生物素最适添加量为50μg/L;利用膜偶联透析发酵方式有效解除了发酵生产过程中产生的反馈抑制现象,降低了副产物的产量,提高了L-缬氨酸的转化率及产量。与原单批次发酵的工艺相比,新工艺的最终L-缬氨酸总量达到106.1 g/L,产量提高了47.4%,糖酸转化率提高到34.5%。

关键词： L-缬氨酸 L-丙氨酸生物素谷氨酸棒杆菌膜偶联间歇透析发酵

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利用膜透析技术提高腺苷发酵产量

食品与发酵工业 2021年第23期47卷 30-37页

作者：梅漫莉孙鹏杰徐庆阳天津科技大学生物工程学院天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

为提高发酵法生产腺苷的产量,解决现有发酵产腺苷周期短,葡萄糖转化成腺苷的效率较低等问题,以Bacillus subtilis XGL(8-AG^(r)+His^(-)+xan^(-)+SG^(r))为供试菌株,进行膜透析发酵生产腺苷的研究。在5 L发酵罐中发酵生产腺苷,分别在36... 详细信息

为提高发酵法生产腺苷的产量,解决现有发酵产腺苷周期短,葡萄糖转化成腺苷的效率较低等问题,以Bacillus subtilis XGL(8-AG^(r)+His^(-)+xan^(-)+SG^(r))为供试菌株,进行膜透析发酵生产腺苷的研究。在5 L发酵罐中发酵生产腺苷,分别在36、60 h对发酵液进行2次膜偶联透析,使发酵周期延长至96 h,菌体OD_(600 nm)提高到94.6,单批次产苷448.3 g,平均产苷44.2 g/L,糖苷转化率提高到25.1%。相比传统发酵工艺,膜偶联间歇透析发酵使得产苷周期延长36~40 h,菌体量增加29.6%,单罐产量增加298.4 g,糖苷转化率提高8.8%。通过膜透析使副产物乙偶姻的产量降低,更多的碳源流向腺苷合成途径。在发酵52 h时检测透析发酵中磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)转酰胺酶和腺苷琥珀酸合成酶酶活力,相比于正常发酵工艺均有所提高。得出通过膜偶联间歇透析发酵法生产腺苷能有效解除发酵液内产物的反馈抑制作用,降低副产物的质量浓度,延长发酵周期,有效提高发酵液的菌体量、腺苷产量和糖苷转化率。

关键词：透析发酵腺苷反馈抑制酶活力

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代谢工程优化大肠杆菌高效合成L-苯丙氨酸

食品科学 2021年第2期42卷 114-120页

作者：门佳轩熊博郝亚男李旋刘益宁谢希贤天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457

为获得1株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入已解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确... 详细信息

为获得1株稳定高产的L-苯丙氨酸工程菌株,利用规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9技术,在大肠杆菌W3110中引入已解除反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA,随后利用不同强度的启动子对莽草酸途径中各反应酶进行调控,并通过摇瓶发酵确定了莽草酸途径各步反应酶的最适表达强度,最后通过增加前体物磷酸烯醇式丙酮酸供应,获得了1株性能最佳的L-苯丙氨酸工程菌株PHE12。利用该菌株进行摇瓶发酵24 h,L-苯丙氨酸产量达20.5 g/L。利用发酵罐分批补料发酵48 h后,L-苯丙氨酸产量达81.8 g/L,与目前文献报道的最高产量相比产量提高了12.2%,生产强度和糖酸转化率(葡萄糖计)分别为1.7 g/(L·h)和0.24 g/g,工业前景良好。

关键词： L-苯丙氨酸大肠杆菌规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9 发酵生产

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L-色氨酸混菌发酵工艺

食品与发酵工业 2019年第14期45卷 115-121页

作者：张震熊海波徐庆阳天津科技大学生物工程学院天津300457 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津300457 天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

为解决L-色氨酸发酵过程中乙酸、乳酸等抑制性副产物积累对对菌体活力和色氨酸积累造成抑制的问题,利用2株色氨酸生产菌,即大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223进行混合发酵,利用谷氨酸棒杆菌代谢大肠杆菌产生的乙酸、乳酸等副产物,降低... 详细信息

为解决L-色氨酸发酵过程中乙酸、乳酸等抑制性副产物积累对对菌体活力和色氨酸积累造成抑制的问题,利用2株色氨酸生产菌,即大肠杆菌TRTH和谷氨酸棒杆菌TQ2223进行混合发酵,利用谷氨酸棒杆菌代谢大肠杆菌产生的乙酸、乳酸等副产物,降低乙酸等副产物对大肠杆菌发酵的负面影响。通过单因素试验确定了混菌发酵的最佳接种间隔时间为14h,谷氨酸棒杆菌TQ2223接种量为7.5%,培养温度为36℃,pH7.0。在最佳工艺条件下进行了30L发酵罐小试验证,结果显示,与普通发酵工艺相比,混菌发酵工艺的乙酸积累量减少84.8%,乳酸积累量减少82.9%,L-色氨酸产量提高13.6%,糖酸转化率提高19.1%。为发酵法高效生产L-色氨酸提供了新方案,为混菌发酵在氨基酸发酵中的应用提供了理论依据。

关键词： L-色氨酸大肠杆菌TRTH 谷氨酸棒杆菌TQ2223 混菌发酵工艺代谢副产物