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重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

生物工程学报 2024年第3期40卷 799-811页

作者：王倩倩刘亚琦屈琰刘欢高歌徐庆阳陈宁范晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,... 详细信息

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

关键词：假尿苷大肠杆菌全细胞催化假尿苷-5-磷酸糖苷酶核糖激酶核糖核苷水解酶

木葡糖酸醋杆菌运动相关基因的敲除及对细菌纤维素合成的影响

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1856-1867页

作者：刘嘉恒王旭彭昭君辛波钟成天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室天津300457 天津科技大学教育部工业发酵微生物重点实验室天津300457

细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在... 详细信息

细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在细菌中,运动相关基因与BC合成有关,而在木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955中,尚不清楚运动相关基因的功能及其对BC合成的影响。本研究利用λ-Red重组系统敲除细菌运动相关基因motA、motB、mot2A,以此构建了敲除菌株K.x-ΔmotA、K.x-ΔmotB、K.x-Δmot2A及双敲菌株K.x-ΔmotAB。结果表明:敲除菌K.x-ΔmotAB的BC产量最高,达到(5.05±0.26)g/L,与野生型菌株相比,提高24%左右;同时,该菌株合成的BC的孔隙率最低,达到了54.35%,并具有更优越的力学性能,杨氏模量可达5.21 GPa。在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中敲除运动相关基因之后,并未降低BC的产量,反而促进了BC的合成,进一步加深了醋酸菌中运动性与BC关系的认知;并且敲除motA和motB基因后,降低了BC的孔隙率并提升了BC的力学性能,为BC合成及膜结构调节改造提供了参考。

关键词：木葡糖酸醋杆菌细菌纤维素运动相关基因基因敲除

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淀粉-枸杞复合物的制备及其稳定性研究

食品工业科技 2024年第6期45卷 186-192页

作者：李淑敏郭晋彪于金芝周雅频张蕾何希宏郝利民张黎明天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 军事科学院系统工程研究院北京100010

为了探讨淀粉(CS)与枸杞(LB)在高速剪切过程中形成淀粉-枸杞复合物(CS-LB)的可能性及客体分子的稳定性,本文考察了高速剪切时间、转速及LB/CS质量比对CS-LB中枸杞色素(LP)质量分数及稳定性的影响,通过扫描电子显微镜(SEM)、X-射线衍射(X... 详细信息

为了探讨淀粉(CS)与枸杞(LB)在高速剪切过程中形成淀粉-枸杞复合物(CS-LB)的可能性及客体分子的稳定性,本文考察了高速剪切时间、转速及LB/CS质量比对CS-LB中枸杞色素(LP)质量分数及稳定性的影响,通过扫描电子显微镜(SEM)、X-射线衍射(XRD)、红外光谱(FT-IR)及热重分析(TGA)对所形成的复合物进行表征。结果表明,当高速剪切时间为1.5 h,转速为12000 r/min,LB与CS的质量比为3:1时,每克产物中LP的含量为0.99±0.03 mg。SEM结果显示产物呈现团聚状;XRD结果显示高速剪切处理破坏了淀粉颗粒的结晶域,转为无定形结构,CS与LB各组分间相互作用使得CS-LP的晶型转变为V型;FT-IR结果显示3421 cm^(-1)处的吸收峰发生变化,可知CS和LB中的活性物质通过氢键结合;TGA结果显示该产物具有较好的热稳定性,600℃时复合物的质量保留率为36%,由此说明高速剪切处理能够较好地制备CS-LB,通过对复合物的稳定性研究发现该复合物可有效降低温度,氧气和光照对客体分子稳定性的影响,延长客体分子的保存期限,使其更好地发挥相关功能。

关键词：枸杞淀粉高速剪切法

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代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2024年第08期 2432-2443页

作者：姚卓越李然蒋帅吴鹤云马倩谢希贤天津科技大学生物工程学院天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的... 详细信息

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的工程菌株。首先，依次敲除deoA、tdk、udp、rihA、rihB、rihC基因，以阻断胸苷的分解途径和补救途径；随后，引入来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F126的嘧啶核苷操纵子基因，以增强前体物尿苷酸合成途径代谢通量；最后，依次优化胸苷合成途径中尿苷酸激酶、核糖核苷二磷酸还原酶、胸苷酸合酶和5′-核苷酸酶的表达，以强化尿苷至胸苷合成途径代谢通量。所构建的THY6-2工程菌株在5 L分批补料发酵试验中胸苷产量为11.10g/L、转化率为0.04g/g葡萄糖、生产强度为0.23g/(L·h)。本研究构建了以葡萄糖为唯一碳源且不携带质粒的高效合成胸苷工程菌株，为其他嘧啶核苷类产品的研发提供了借鉴。

关键词：胸苷大肠杆菌代谢工程从头合成途径

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骨化二醇及骨化三醇生物合成研究进展

生物工程学报 2024年第6期40卷 1601-1619页

作者：艾佳莹高吉凯殷子扬毛淑红工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津市工业微生物学重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

维生素D_(3)是对人体健康十分重要的维生素,可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH)VD_(3)]和骨化三醇[1α,25(OH)_(2)VD_(3)]是维生素D_(3)的两种活性衍生物,在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目... 详细信息

维生素D_(3)是对人体健康十分重要的维生素,可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH)VD_(3)]和骨化三醇[1α,25(OH)_(2)VD_(3)]是维生素D_(3)的两种活性衍生物,在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目前,骨化二醇及骨化三醇的生产以化学合成居多,但化学合成具有产物产量低、副产物多以及对环境不友好等缺点。因此开发一种绿色、安全、对环境友好的生物催化合成途径显得尤为重要。本文综述了骨化二醇及骨化三醇的生物催化合成途径,并介绍了该途径中的关键酶P450酶,包括P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,CYPs)和P450过加氧酶(unspecific peroxygenases,UPOs)。其中研究较为广泛的是P450单加氧酶,通过解析其催化作用机制,分析不同氧化还原伴侣适配以及关键氨基酸残基对酶催化活性的重要影响。此外,对利用H2O2驱动的UPOs的催化机理、高效异源表达策略以及H2O2的原位再生等方面也进行了总结,UPOs优势在于既不需要昂贵的辅因子也不需要氧化还原伴侣的参与,是十分有前景的生物催化剂。本文为进一步开发或改造相关P450酶来高效生产VD_(3)活性衍生物提供了重要的参考。

关键词：骨化二醇骨化三醇 P450s 生物催化合成

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

一株产L-苹果酸黑曲霉菌株的诱变筛选及发酵培养基优化

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食品工业科技 2024年第8期45卷 165-173页

作者：刘书彤石冰冰谭奕阳厉成伟魏彩霞王德培薛鲜丽天津科技大学生物工程学院天津300457 山东日照金禾博源生化有限公司山东日照276800 工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

为筛选一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,通过紫外诱变与高浓度放线菌酮迭代诱变的方法,将野生型菌株诱变为一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,并对其种子或发酵培养基成分进行优化。结果表明,诱变所得一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉CGM... 详细信息

为筛选一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,通过紫外诱变与高浓度放线菌酮迭代诱变的方法,将野生型菌株诱变为一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,并对其种子或发酵培养基成分进行优化。结果表明,诱变所得一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉CGMCC NO.40550菌株,其摇瓶发酵时种子培养基最适葡萄糖浓度为60 g/L、最适氮源为(NH_4)_2SO_4 4.95 g/L,黑曲霉菌球形成最优转速220 r/min;发酵培养基最适葡萄糖和最适(NH_4)_2SO_4浓度分别为180 g/L和4.95 g/L,Cu SO_4·5H_2O为其生产苹果酸最佳微量元素,最适添加量为0.065 g/L。通过单因素实验的优化,优化后的培养基更有利于L-苹果酸的合成,发酵96 h时L-苹果酸产酸量达到18.15 g/L,显著提高了245%,L-苹果酸占总酸的百分比达到71.69%。本研究为L-苹果酸的工业化生产奠定基础。

关键词：黑曲霉紫外诱变 L-苹果酸摇瓶发酵培养条件

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基于转录调节因子PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的构建与优化

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生物工程学报 2024年

作者：刘俊杰蒋敏敏孙彤孙祥祥赵咏灿顾明霞路福平黎明工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4... 详细信息

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4-丁二胺生物传感器的广泛适用。本研究开发了一种以转录调节因子PuuR为基础的1，4-丁二胺生物传感器，其同源的操作子puuO被安装在大肠杆菌组成型启动子PgapA中，以控制下游的高能绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein， sfGFP）作为报告蛋白表达。采用大肠杆菌基因组中不同强度的启动子对1，4-丁二胺生物传感器进行分子改造，探究并改进基于PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的功能性质，为高通量筛选高产1，4-丁二胺的工程菌株奠定基础。

关键词：大肠杆菌 1,4-丁二胺生物传感器转录调节因子PuuR

基于异源表达和甲基化修饰制备抗自切重组胰蛋白酶

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微生物学报 2024年

作者：于文娟许伟洲孙娜娜孙颖李玉强杨霁菡路福平王洪彬天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【... 详细信息

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【方法】通过基因重组技术实现猪胰蛋白酶酶原在毕赤酵母中的异源表达；通过单因素试验对酶原激活的温度、pH和时间进行考察和优化；通过探索甲基化修饰方法提高重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结果】成功构建了胰蛋白酶酶原的毕赤酵母工程菌株，优化了酶原的肠激酶激活条件，考察了胰蛋白酶浓度、甲基化试剂添加量和反应时间对甲基化效果的影响，在胰蛋白酶浓度10 mg/mL，甲基化试剂添加量30 μL，反应时间3 h条件下，所获甲基化酶在酶活损失仅22%情况下，自切6 h酶活保留率提高达到了79%，相比对照提高了约3.4倍，大幅提高了重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结论】本研究基于异源表达和甲基化修饰成功制备了新型抗自切重组胰蛋白酶，该成果有助于提高我国胰蛋白酶的生产和应用水平。

关键词：胰蛋白酶甲基化抗自切