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二甲双胍对Ⅰ型成骨不全小鼠间充质干细胞成骨分化的影响及疗效探讨

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天津医药 2023年第8期51卷 830-834页

作者：王娟赵玉霞茹雅维汪子涵付婷李光天津医科大学基础医学院遗传学系 300070

目的研究二甲双胍对Ⅰ型成骨不全小鼠(oim)脂肪间充质干细胞(oimADSCs)向成骨细胞分化的影响并初步探讨二甲双胍在oim中的治疗效果。方法从oim中分离培养oimADSCs,通过观察细胞形态,碱性磷酸酶(ALP)染色和油红O染色对其分化能力进行鉴定... 详细信息

目的研究二甲双胍对Ⅰ型成骨不全小鼠(oim)脂肪间充质干细胞(oimADSCs)向成骨细胞分化的影响并初步探讨二甲双胍在oim中的治疗效果。方法从oim中分离培养oimADSCs,通过观察细胞形态,碱性磷酸酶(ALP)染色和油红O染色对其分化能力进行鉴定;将oimADSCs分组进行诱导培养,通过观察ALP染色、检测ALP活性和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测几种成骨分化相关分子的表达情况,分析二甲双胍对oimADSCs向成骨细胞分化的影响;利用微计算机断层扫描技术(Micro-CT)分析股骨的骨骼微观结构,观察二甲双胍在oim模型小鼠中的治疗效果。结果在二甲双胍处理oimADSCs后,ALP染色显著加深、ALP活性显著提高,骨钙素(Bglap)、Ⅰ型胶原(Col1a1)、Runt相关转录因子2(Runx2)以及骨形成蛋白2(BMP2)的mRNA表达水平升高;Micro-CT分析发现oim模型小鼠经过二甲双胍治疗后,股骨骨小梁的骨体积/总体积增加,股骨骨小梁数目增多、厚度增加。结论二甲双胍能够促进oimADSCs向成骨细胞分化,改善oim的骨骼生长情况。

关键词：成骨不全间质干细胞二甲双胍 Ⅰ型成骨不全脂肪间充质干细胞成骨分化

糖化血红蛋白与颈动脉内膜-中膜厚度的相关性研究

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天津医药 2022年第10期50卷 1061-1065页

作者：李雪敏李卫东时文涛魏凤江天津医科大学基础医学院医学遗传学系 300070

目的研究普通体检人群糖化血红蛋白(HbA1c)水平与颈动脉内膜-中膜厚度(CIMT)的相关性。方法选取9881例普通体检人群为研究对象,其中男7091例,女2790例,采用血管彩色多普勒超声测量CIMT。根据是否有CIMT增厚,分为增厚组(4513例)和正常组(... 详细信息

目的研究普通体检人群糖化血红蛋白(HbA1c)水平与颈动脉内膜-中膜厚度(CIMT)的相关性。方法选取9881例普通体检人群为研究对象,其中男7091例,女2790例,采用血管彩色多普勒超声测量CIMT。根据是否有CIMT增厚,分为增厚组(4513例)和正常组(5368例)。收集2组的一般资料和实验室资料并进行比较。采用Logistic回归分析总人群及不同性别中CIMT增厚的危险因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价HbA1c水平对CIMT增厚的预测效果。结果与正常组相比,增厚组的男性比例、年龄、体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、直接胆红素(DBIL)、球蛋白(GLB)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血糖(GLU)、HbA1c、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平均升高,而估算肾小球滤过率(eGFR)、丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,在总人群中高龄,男性,ALB、GLU、LDL-C升高,HbA1c≥5.7%是CIMT增厚的危险因素,GLB、HDL-C升高是CIMT增厚的保护因素。男性人群中高龄,ALB、LDL-C升高,HbA1c≥5.7%是CIMT增厚的危险因素,ALT、GLB、HDL-C升高是CIMT增厚的保护因素;女性人群中SBP、TC升高,HbA1c≥5.6%是CIMT增厚的危险因素,BMI、eGFR、ALB、Scr、HDL-C升高是CIMT增厚的保护因素。ROC曲线结果分析显示,HbA1c在总人群、男性和女性中预测CIMT增厚的最佳截断值均为5.65%,女性中HbA1c对CIMT增厚的预测效能较优。结论在普通人群中HbA1c水平升高为CIMT增厚的危险因素,且在女性人群中,HbA1c对CIMT增厚的影响更大。

关键词：血红蛋白A,糖基化颈动脉回归分析颈动脉内膜-中膜厚度普通人群

SENP1在SPOP去SUMO化修饰中的作用研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2024年第6期44卷 753-761页

作者：张赟豪韩博昂王瑜朱琴乐珅俞婷婷程雁刘晨南京医科大学基础医学院医学遗传学系江苏南京211166

目的:研究小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰对SPOP(speckle type BTB/POZ protein)蛋白水平和细胞定位的影响,并尝试在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中探讨SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific proteases 1,SENP1)和SPOP之间的相关性。方法:利用野生型(wild type,WT)和Senp1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞研究Senp1对Spop蛋白水平和细胞定位的影响,并通过比较外源WT-Spop和Spop的SUMO修饰位点突变体的蛋白表达量,进一步确认SUMO修饰对Spop蛋白水平的影响。后续通过邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)研究WT-Spop及其SUMO修饰位点突变体与SUMO1的结合能力。最后通过ccRCC患者的RNA表达数据和ccRCC细胞系探讨SENP1和SPOP在ccRCC中的相关性。结果:Senp1敲除下调小鼠胚胎成纤维细胞中Spop的蛋白量和稳定性,但不影响其细胞核定位。突变Spop的SUMO修饰位点后,其与Sumo1的结合能力下降,蛋白量也有所降低。SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。结论:Senp1通过去SUMO化修饰稳定Spop蛋白,SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。

关键词： SPOP SENP1 SUMO修饰肾透明细胞癌

阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

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中国骨质疏松杂志 2019年第4期25卷 431-438页

作者：刘硕刘义王建海赵玉霞李光天津医科大学基础医学院遗传学系天津300070

目的探讨阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响。方法从Ⅰ型成骨不全小鼠的脂肪组织中分离培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs^(col1a1+/-)),经流式细胞仪检测其表面间充质干细胞相关Marker CD 29、CD 4... 详细信息

目的探讨阿司匹林对Ⅰ型成骨不全小鼠脂肪来源间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响。方法从Ⅰ型成骨不全小鼠的脂肪组织中分离培养的脂肪间充质干细胞(ADSCs^(col1a1+/-)),经流式细胞仪检测其表面间充质干细胞相关Marker CD 29、CD 45等的表达情况,并在成骨诱导7 d后进行ALP染色、成脂诱导14 d后进行油红O染色,验证ADSCs^(col1a1+/-)的成骨和成脂分化潜能;分别配制含0、0.5、1、1.5、2、5、10 mmol/L阿司匹林的培养基,MTS检测不同浓度阿司匹林对ADSCs^(col1a1+/-)增殖的影响;将ADSCs^(col1a1+/-)分为对照组、单纯成骨诱导组和加入1.5 mmol/L阿司匹林的成骨诱导+阿司匹林组进行成骨诱导,比较ALP染色结果及ALP活性,qPCR检测成骨相关基因及相关信号通路因子转录水平的变化。结果分离培养的ADSCs^(col1a1+/-)高表达间充质干细胞相关Marker CD 29及CD 45,低表达CD 44,并具有成骨、成脂分化潜能;低、中浓度(0～2 mmol/L)的阿司匹林可促进ADSCs^(col1a1+/-)增殖,高浓度(5～10 mmol/L)时则抑制,浓度为1.5 mmol/L时促增殖效果最明显;与对照组和单纯成骨诱导组相比,成骨诱导+阿司匹林组的ALP表达明显增强,成骨相关基因col1a1、bglap、runx2、osterix和Wnt信号通路中β-catenin以及TGF-β通路中bmp2的转录水平有显著上调。结论阿司匹林能够促进ADSCs^(col1a1+/-)的增殖和成骨分化,可能是通过Wnt及TGF-β信号通路来促进成骨分化的。

关键词：阿司匹林成骨不全脂肪间充质干细胞

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不同固定方法对初级纤毛蛋白免疫荧光的影响

南京医科大学学报（自然科学版） 2023年第3期43卷 343-348,379页

作者：李田元王悦艾紫荷刘晨俞婷婷程雁乐珅南京医科大学基础医学院医学遗传学系江苏南京211166

目的:比较不同固定方法对动物细胞初级纤毛组分免疫荧光染色的影响,探究初级纤毛免疫荧光成像的优化策略。方法:选择4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、甲醇(MeOH)、10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)固定细胞,后续使用相同的透... 详细信息

目的:比较不同固定方法对动物细胞初级纤毛组分免疫荧光染色的影响,探究初级纤毛免疫荧光成像的优化策略。方法:选择4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、甲醇(MeOH)、10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)固定细胞,后续使用相同的透化、封闭、抗体孵育条件,最后比较相同拍摄参数下初级纤毛的成像效果。结果:PFA固定法可使纤毛轴丝蛋白和部分纤毛膜蛋白有更好的染色效果,MeOH固定法可以更清晰地展现纤毛底部定位的蛋白。相比前两种方法,TCA固定的细胞虽然纤毛轴丝的染色效果很差,但适用于部分纤毛膜蛋白和轴丝结合蛋白。除荧光强弱不同外,使用不同方法固定后染色得到的蛋白定位也有微小差异。结论:3种固定方法在初级纤毛免疫荧光实验中各有优劣,需要综合考虑实验目的以及目标蛋白的特点进行选择。

关键词：初级纤毛固定细胞免疫荧光

结合亲和质谱与生物信息学分析构建TP53BP1的蛋白相互作用网络

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中国科学：生命科学 2018年第2期48卷 232-239页

作者：王浩王春晴陈瑞冰天津医科大学基础医学院遗传学系天津300070

蛋白质与蛋白质相互作用(PPIs)是两个或更多蛋白质分子之间通过静电作用、范德华力等建立的高度特异性的物理接触.细胞内的各种蛋白分子通过PPIs进行彼此之间的功能调节、信号通路的交互作用等,从而实现各种生物进程,而异常的PPIs也将... 详细信息

蛋白质与蛋白质相互作用(PPIs)是两个或更多蛋白质分子之间通过静电作用、范德华力等建立的高度特异性的物理接触.细胞内的各种蛋白分子通过PPIs进行彼此之间的功能调节、信号通路的交互作用等,从而实现各种生物进程,而异常的PPIs也将导致疾病的发生、发展,其中就包括肿瘤.因此围绕某些和疾病密切相关的关键蛋白构建其相互作用生物网络(interactome)将有助于更好地分析该关键蛋白在疾病中的作用和可能的分子机制.本研究针对抑癌基因p53结合蛋白1(TP53BP1),利用亲和质谱分析鉴定了15个潜在的TP53BP1相互作用蛋白.同时,结合PPI数据库检索构建了与TP53BP1相互作用的蛋白质网络,并对该网络中的蛋白进行了功能富集分析、通路分析,结果显示,TP53BP1相互作用蛋白主要富集在细胞周期、同源重组、错配修复等重要通路,该研究为深入解析TP53BP1的生物学功能及其在肿瘤中的作用奠定了基础.

关键词： TP53BP1 蛋白质相互作用功能富集分析亲和质谱分析

利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

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遗传 2019年第5期41卷 422-429,451-461页

作者：王珏黄娟许蕊南京医科大学基础医学院医学遗传学系南京211166

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。

关键词：果蝇无缝基因组编辑 CRISPR/Cas9 piggyBac

GADD45A通过端粒替代延长途径调控骨肉瘤细胞增殖

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天津医科大学学报 2023年第3期29卷 265-271页

作者：韩鑫宇李婷芳王峰天津医科大学基础医学院医学遗传学系天津300070

目的:探讨GADD45A对骨肉瘤细胞的增殖和端粒调控功能。方法:应用siRNA和shRNA处理骨肉瘤细胞U2OS,观察骨肉瘤细胞增殖、端粒功能和端粒延长替代途径的变化。qPCR检测GADD45A敲低后mRNA水平。CCK-8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖... 详细信息

目的:探讨GADD45A对骨肉瘤细胞的增殖和端粒调控功能。方法:应用siRNA和shRNA处理骨肉瘤细胞U2OS,观察骨肉瘤细胞增殖、端粒功能和端粒延长替代途径的变化。qPCR检测GADD45A敲低后mRNA水平。CCK-8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞增殖情况。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验检测端粒功能变化。免疫荧光-荧光原位杂交实验和C-circle实验检测端粒损伤情况和端粒延长替代途径相关表型。结果:qPCR结果表明,siRNA敲低GADD45A后mRNA水平降低(t=25.96,P<0.0001);shGADD45A-1和shGADD45A-2 GADD45A的mRNA水平降低(t=21.12、18.37,均P<0.0001)。对应的CCK-8(t=5.051、6.192、3.775、14.86、22.93、3.013、14.61、20.93,均P<0.05)和克隆形成实验(t=46.68、23.73、24.98,均P<0.0001)结果表明,敲低GADD45A抑制了骨肉瘤细胞增殖。细胞中期分裂相-荧光原位杂交实验结果显示,GADD45A缺失会加重端粒多信号(t=24.04、7.243、27.93,均P<0.01)和端粒信号缺失现象(t=8.222、16.61、6.781,均P<0.01)。免疫荧光-荧光原位杂交实验结果表明,siRNA敲低GADD45A后H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒的共定位增加(t=19.16、10.65,均P<0.0001);shGADD45A-1、shGADD45A-2也证实了H2AX组蛋白变体和早幼粒细胞白血病体与端粒共定位的比例升高(t=14.71、24.03、16.69、18.10,均P<0.0001)。C-circle实验结果表明,siRNA敲低GADD45A以及shGADD45A-1和shGADD45A-2两细胞系中染色体外端粒DNA环C-circle水平升高(t=41.27、14.06、4.539,均P<0.05)。结论:GADD45A调控端粒延长替代途径、保护端粒功能并促进骨肉瘤细胞增殖。

关键词： GADD45A 骨肉瘤端粒端粒替代延长途径

钙离子通道亚基Cacnb3对小鼠脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

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中国细胞生物学学报 2019年第8期41卷 1506-1516页

作者：伏玺王峰天津医科大学基础医学院遗传学系

间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有重要意义,但其在成骨分化中的机制尚未完全阐明。该研究通过分析GEO数据库中有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)处理过的小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片数据,筛选出22个在成... 详细信息

间充质干细胞在治疗骨相关疾病中具有重要意义,但其在成骨分化中的机制尚未完全阐明。该研究通过分析GEO数据库中有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)处理过的小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1 preosteoblasts)的生物芯片数据,筛选出22个在成骨分化中上调,在成脂分化中下调,且受HDACi紧密调控的基因。这22个基因中有6个基因(Cacnb3、Lpcat2、Cd248等)与Ca2+调节功能相关,提示Ca2+可能在MSCs分化中发挥重要作用。在后续实验中,我们观察到电压依赖性钙通道亚单位β3(calcium voltage-gated channel auxiliary subunit beta 3, Cacnb3)和磷脂酰基转移酶2(lysophosphatidylcholine acyltransferase 2, Lpcat2)在小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)、人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)的成骨分化过程中上调,提示Cacnb3、Lpcat2可能参与ADSCs的体外成骨分化。此外,利用钙离子荧光探针检测方法,发现敲低Cacnb3后3T3-E1细胞内Ca2+浓度明显低于对照组,同时,成骨相关基因(ALP、Runx2)表达显著下调,表明Cacnb3可能通过影响Ca2+浓度调控细胞的成骨分化,该研究为进一步探索间充质干细胞成骨分化的机制奠定了基础。

关键词：脂肪组织间充质干细胞钙离子细胞分化基因表达谱