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不同种类预过滤膜对纳米膜（DV20 nm）过滤人免疫球蛋白效果的影响

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中国生物制品学杂志 2019年第12期32卷 1418-1420,1424页

作者：彭焱李陶敬邹浩勇陈克金胡勇国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部

目的比较不同种类预过滤膜对纳米膜(DV20 nm)过滤人免疫球蛋白效果的影响。方法以A、B、C厂家生产的纳米膜(DV20 nm)和不同预过滤膜对1 000 mL 5. 3%IgG样品进行膜通量筛选实验,比较蛋白回收率及通量;应用筛选的预过滤膜和纳米膜对样品... 详细信息

目的比较不同种类预过滤膜对纳米膜(DV20 nm)过滤人免疫球蛋白效果的影响。方法以A、B、C厂家生产的纳米膜(DV20 nm)和不同预过滤膜对1 000 mL 5. 3%IgG样品进行膜通量筛选实验,比较蛋白回收率及通量;应用筛选的预过滤膜和纳米膜对样品中滴度为6. 50 LgTCID50/0.1 mL猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行去除病毒验证。结果选取A厂Minisart预过滤膜,120 min通量为7. 68 L/(m^2·h),蛋白回收率为96. 1%;B厂FTKDJL预过滤膜,120、300及400 min通量分别为9.87、3. 93和1. 85 L/(m^2·h),蛋白回收率为97. 6%。A及B厂的纳米膜过滤约1 200 min,通量分别为2. 39和3. 74 L/(m^2·h),指示病毒PPV下降滴度分别为≥4. 63和≥4.25 LgTCID50/0. 1 mL,均能在有效过滤量之内完全去除PPV,蛋白回收率均在96%以上。结论不同预过滤膜对纳米膜过滤通量有明显影响,筛选的预过滤膜及纳米膜均可有效去除PPV,可用于人免疫球蛋白规模化生产工艺。

关键词：预过滤膜纳米膜人免疫球蛋白猪细小病毒通量

新型冠状病毒中和抗体胶体金测试卡检测不同人群中和抗体的可行性分析

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中国新药杂志 2021年第19期30卷 1775-1782页

作者：周志军彭焱纪德铭张勇冯璐李陶敬夏冬梅胡勇李策生国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部武汉430207 北京天坛生物制品股份有限公司研发中心北京100024

目的:比较2种不同原理制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体胶体金测试卡与SARS-CoV-2假病毒中和实验的相关性,评估半定量的中和抗体胶体金测试卡用于不同人群的SARS-CoV-2中和抗体检测的可行性。方法:分别采用厂家A胶体金测试卡(双... 详细信息

目的:比较2种不同原理制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体胶体金测试卡与SARS-CoV-2假病毒中和实验的相关性,评估半定量的中和抗体胶体金测试卡用于不同人群的SARS-CoV-2中和抗体检测的可行性。方法:分别采用厂家A胶体金测试卡(双抗原夹心法)、厂家B胶体金测试卡(竞争阻断法)和SARS-CoV-2假病毒中和法进行检测,比较这2种胶体金方法与中和实验的相关性和敏感度;在确定了测试卡厂家后,检测新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情暴发前制备的静注人免疫球蛋白及特异性免疫球蛋白,考察其特异性;对ELISA高稀释倍数新冠疫苗免疫后血浆进行原倍和稀释品检测,判断是否有hook效应;检测不同ELISA稀释倍数档位的单份免疫后血浆,判断阳性率,观察色度变化;将ELISA低稀释倍数血浆按照比色卡筛选120NT_(50)和300NT_(50)这2个档位血浆,制备混浆,比较胶体金测试卡与ELISA和中和抗体的相关性。结果:厂家A和厂家B对英国国家生物制品标准化和质量控制研究所(NIBSC)第1代国际标准品20/136(抗SARS-CoV-2人免疫球蛋白国际标准品)的检测限分别为0.6125和5 IU·mL^(-1);对不同档位的混浆(新冠病毒疫苗免疫后血浆及COVID-19康复者恢复期血浆)的检测结果与中和抗体效价相关性好,检测ELISA高稀释倍数(10000以上)新冠病毒疫苗免疫后血浆未出现hook效应;不同ELISA稀释倍数的单份血浆的阳性率在稀释倍数160以上达到100%,但是色度深浅不一,在稀释倍数640以上色度均一性较高,且色度随着ELISA稀释倍数增高整体逐渐变深。按照比色卡色度筛选的Ppool 120NT_(50)和Ppool 300NT_(50)与中和抗体效价接近。结论:采用双抗原夹心法的厂家A中和抗体测试卡检测COVID-19康复者恢复期血浆和新冠病毒疫苗免疫后血浆的结果与假病毒中和实验效价的相关性优于采用竞争抑制法的厂家B产品及间接ELISA,且检测线的色度深浅与中和抗体水平正相关,可半定量检测用于不同人群的中和抗体筛查。

关键词：新型冠状病毒中和抗体胶体金测试卡假病毒中和实验效价 ELISA稀释倍数检测限免疫后血浆康复者恢复期血浆

柱前衍生HPLC法测定人凝血因子Ⅷ中氨基酸的含量

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中国生物制品学杂志 2019年第12期32卷 1402-1406,1410页

作者：王月喻剑虹刘莹罗晶郑宵蓓张雪龚钦国药集团武汉血液制品有限公司

目的建立人凝血因子Ⅷ中氨基酸含量的柱前衍生HPLC检测方法。方法采用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimide carbamate,AQC)在一定条件下与氨基酸形成稳定的衍生产物(柱前衍生),再通过... 详细信息

目的建立人凝血因子Ⅷ中氨基酸含量的柱前衍生HPLC检测方法。方法采用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimide carbamate,AQC)在一定条件下与氨基酸形成稳定的衍生产物(柱前衍生),再通过高效液相色谱仪,采用氨基酸分析柱(150 mm×3.9 mm,4μm)检测,以不同流动相进行梯度洗脱[在《中国药典》三部(2015版)的基础上进行调整],柱温为37℃,流速为1.0 mL/min,检测波长为248 nm。同时验证方法的系统适应性、专属性、线性范围、精密性及准确度。结果甘氨酸及盐酸赖氨酸均可在25 min内获得较好分离,与相应相邻色谱峰之间的分离度均>1.5,拖尾因子在0.95~1.40之间;各样品的氨基酸种类均能正确检出,混合样品与单纯样品出峰时间保持一致,且供试品溶液与对照品溶液主峰保留时间相对偏差均<2%;当甘氨酸浓度在12.5~62. 5μg/mL,盐酸赖氨酸浓度在4.0~20.0μg/mL时,与相应氨基酸与内标峰面积比呈良好的线性关系,相关系数(r)分别为0.999 9和0.999 8;甘氨酸及盐酸赖氨酸重复性的相对标准偏差(RSD)分别为0.4%和0.5%,中间精密度RSD分别为1.3%和1.0%;两种氨基酸的回收率均在95%~105%范围内,RSD均≤2%。结论建立的方法具有良好的专属性、精密性及准确度,可用于测定人凝血因子Ⅷ中的氨基酸含量。

关键词：人凝血因子Ⅷ 氨基酸含量柱前衍生化 HPLC 甘氨酸盐酸赖氨酸

紫外-可见分光光度法检测高纯度人C1酯酶抑制剂蛋白质含量的经验公式

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微生物学免疫学进展 2023年第3期51卷 28-35页

作者：汪菲菲李娟陈克金朱晨纪德铭王上彭焱李策生胡勇周志军国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部湖北武汉430207

目的建立高纯度人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)蛋白质含量(质量浓度)检测的紫外-可见光分光光度法(简称A_(280 nm)法),得到双对数方程的经验公式,用于C1-INH精纯阶段含目标蛋白样品的蛋白质含量在线检测。方法以1批高效... 详细信息

目的建立高纯度人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)蛋白质含量(质量浓度)检测的紫外-可见光分光光度法(简称A_(280 nm)法),得到双对数方程的经验公式,用于C1-INH精纯阶段含目标蛋白样品的蛋白质含量在线检测。方法以1批高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度98.49%的C1-INH原液作为对照品,用注射用水稀释获得不同质量浓度的稀释品,分别检测稀释品A_(280 nm)值,以稀释品的A_(280 nm)值与理论质量浓度进行不同方程的线性拟合,选取回收率在理论值100%±10%、R^(2)>0.99的质量浓度区间建立最佳拟合方程。在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合得到不同的方程,对2种拟合方程的准确度、精密度和稳定性进行验证。通过原始值均值方程和不同基质液的检测均值来建立经验公式,用该经验公式计算不同批次纯化工艺中间样品的蛋白质质量浓度并与免疫比浊法和凯氏定氮法的检测结果进行比较,确定其准确性。用该经验公式指导C1-INH精纯样品的检测。结果建立的A_(280 nm)法采用双对数方程拟合标准曲线的线性范围为0.214~3.567 mg/mL;在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合双对数方程,2个标准曲线的重复性和稳定性均较好,且高、中、低值质控品及检测下限的准确度(即回收率)<100%±7%,精密度CV<3%。含目标蛋白质的多种基质液按照原始均值方程计算得到对应的蛋白质质量浓度在0.044~0.064 mg/mL,均值为0.051 mg/mL;经验公式为:蛋白质质量浓度x={10(lg(y)+0.3820.764)-0.051}×稀释倍数,用该公式计算的添加了对照品的各基质的回收率在96.636%~109.533%。检测不同批次纯化工艺中间样品的结果显示,对于精纯样品,该经验公式与凯氏定氮法的结果比值在0.93~1.12,免疫比浊法结果与凯氏定氮法的结果比值在1.19~2.33。用该经验公式计算的不同精纯阶段中间样品的结果与凯氏定氮法结果更接近。结论建立的A_(280 nm)法经验公式可用于精纯阶段的高纯度C1-INH样品的蛋白质含量在线快速检测。

关键词：蛋白质含量检测的紫外-可见光分光光度法免疫比浊法凯氏定氮法人C1酯酶抑制剂线性范围

人C1酯酶抑制剂抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

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微生物学免疫学进展 2023年第2期51卷 25-33页

作者：李娟汪菲菲彭焱陈克金朱晨纪德铭王上胡勇周志军国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部湖北武汉430207

目的建立C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor, C1-INH)抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,验证后用于C1-INH纯化工艺摸索。方法用羊抗人C1-INH抗体作为捕获抗体,用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人C1-INH抗体作为检测抗体,进行棋盘滴定... 详细信息

目的建立C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor, C1-INH)抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,验证后用于C1-INH纯化工艺摸索。方法用羊抗人C1-INH抗体作为捕获抗体,用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人C1-INH抗体作为检测抗体,进行棋盘滴定初步确定捕获抗体的工作质量浓度,用西门子血浆标准品进行系列稀释作为标准品经过2轮实验来确定拟合曲线和线性范围及检测抗体的工作质量浓度,用血浆标准品标定电泳C1-INH标准品(电泳纯度>92%),分析与血浆标准品的平行性来选择本方法最终使用的标准品,最终建立了C1-INH抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法。对此方法进行线性、准确度、精密度、加样回收率、电泳标准品稳定性的验证。将验证后的方法用于C1-INH纯化工艺的摸索及产品质量分析,并与特定蛋白检测仪的结果进行比较。结果捕获抗体质量浓度为400.000 ng/mL,检测抗体质量浓度为400.000 ng/mL,标准曲线采用四参数方程拟合,电泳标准品的质量浓度为0.895 mg/mL,血浆标准品作为本方法标准品;标准曲线的线性范围为1.560~100.000 ng/mL,各质量浓度标准品回收率在83.35%~112.19%,CV部质量控制指标,主要用于工艺摸索中低质量浓度C1-INH的抗原含量检测。

关键词： C1-INH抗原含量双抗体夹心ELISA 棋盘滴定验证

SARS-Co V-2抗原检测用样品盘的建立及其在胶体金测试卡研发和质量评估中的应用

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中国生物制品学杂志 2022年第3期35卷 293-298,303页

作者：施金荣周志军程小玲杨爽李茜罗敏石艳红李策生李陶敬武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207 国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部湖北武汉430207 北京天坛生物制品股份有限公司研发中心北京100024

目的建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗原检测用样品盘,并应用于SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡的研发及质量评估。方法以12种非SARS-CoV-2灭活疫苗原液及黏蛋白作为阴性样品... 详细信息

目的建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗原检测用样品盘,并应用于SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡的研发及质量评估。方法以12种非SARS-CoV-2灭活疫苗原液及黏蛋白作为阴性样品盘,重组SARS-CoV-2 N蛋白、2批SARS-CoV-2灭活疫苗原液(B1、B2)及1批灭活SARS-CoV-2培养液(S1)作为阳性样品盘,二者结合建立SARS-CoV-2抗原检测用样品盘。采用B1对4个厂家(A、B、C、D)的胶体金测试卡进行阳性评估,并对厂家A胶体金测试卡的研发进行全程检测。通过阴性样品盘评价5个厂家(A、C、E、F、G)胶体金测试卡的特异性,阳性样品盘(B2、S1和重组N蛋白)评价其灵敏度。采用市售SARS-CoV-2核酸检测试剂盒检测灭活SARS-CoV-2培养物S1,并与厂家A的胶体金测试卡进行对比。结果通过阳性评估,确定N蛋白为检测SARS-CoV-2抗原的主要位点。厂家A研发的胶体金测试卡对B1的灵敏度达1:2×10^(3)。5个厂家的胶体金测试卡对非SARS-CoV-2灭活疫苗原液无交叉反应,表明特异性均良好。厂家A的胶体金测试卡对B2的灵敏达1:10^(6),对S1的灵敏度达1:2×10^(7);厂家E、F、G的胶体金测试卡对B2的灵敏度达1:10^(3)以上,对S1的灵敏度达1:10^(4)~1:10^(5);厂家C的胶体金测试卡对B2的灵敏度达1:10^(4),对S1的灵敏度达1:10^(6)。厂家A的胶体金测试卡对重组N蛋白的灵敏度为100 pg/mL,其他4家均为10 pg/mL。市售核酸检测试剂盒对S1的灵敏度为1:10^(7),与厂家A的胶体金测试卡(1:2×10^(7))相当。结论成功建立了SARS-CoV-2抗原检测用样本盘,其具有良好的特异性及灵敏性,可用于SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡的研发及质量评估。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 胶体金测试卡抗原检测样品盘质量评估

人C1酯酶抑制剂初步纯化过程pH值和聚乙二醇含量的优化

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国际生物制品学杂志 2020年第3期43卷 126-131页

作者：纪德铭彭焱詹骞周志军汪菲菲陈克金胡勇李策生武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部 430207 国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部 430207

目的探讨pH值、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)含量和离心条件对PEG4000粉末用于去除人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)制备原料中的IgM效果的影响,并通过对羧甲基(carboxymethyl,CM)离子交换层析中洗脱盐离子浓度的筛... 详细信息

目的探讨pH值、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)含量和离心条件对PEG4000粉末用于去除人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)制备原料中的IgM效果的影响,并通过对羧甲基(carboxymethyl,CM)离子交换层析中洗脱盐离子浓度的筛选,分离活性与非活性C1-INH。方法向不同pH值的C1-INH制备原料中加入不同质量分数的PEG4000,于不同条件下离心后,用特定蛋白检测仪对离心后上清液中IgM和C1-INH含量进行检测,确定PEG沉淀法纯化C1-INH的最佳条件。将离心后上清液调节pH后作为CM离子交换层析上样样品,使用不同盐离子浓度的洗脱液对活性C1-INH进行分离,确定最佳的盐离子浓度。结果在弱酸性pH(6.8)下,当PEG4000质量分数为12%,离心条件15000×g、25℃、20 min时,IgM去除率>99%,且C1-INH的回收率>80%;在盐离子浓度为200 mmol/L时,产物中C1-INH的比活性最大(4.43 IU/mg),且绝大多数杂质蛋白得以去除。结论优化条件下,PEG4000能有效去除C1-INH制备原料中的IgM,且能保持较高的C1-INH回收率;CM离子交换层析能对活性与非活性C1-INH进行有效分离,并去除大多数杂质蛋白。

关键词：聚乙烯二醇类 pH值离心法色谱法,离子交换羧甲基纤维素钠人C1酯酶抑制剂

新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆中新型冠状病毒核酸检测方法的验证

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国际生物制品学杂志 2021年第1期44卷 7-12页

作者：王月喻剑虹刘莹罗艳郭佳茹张林林李璞赵传波陈玲向阳张雪陈鄂湘彭干李耀雄何彦林李策生国药集团武汉血液制品有限公司质量控制室 430207 国药集团武汉血液制品有限公司质量保证室 430207 国药集团武汉血液制品有限公司质量管理部 430207 国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部 430207

目的对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)康复者恢复期血浆中新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)核酸检测方法进行系统性验证。方法根据血浆样本实际情况,并结合试剂盒要求,建立COVID-19康复者恢复期血浆中2019-nCoV核酸的实时... 详细信息

目的对新型冠状病毒肺炎(COVID-19)康复者恢复期血浆中新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)核酸检测方法进行系统性验证。方法根据血浆样本实际情况,并结合试剂盒要求,建立COVID-19康复者恢复期血浆中2019-nCoV核酸的实时荧光定量PCR检测方法,并从专属性、检测限(limit of detection, LOD)、重复性及中间精密度对该方法进行系统性的验证,对20份COVID-19康复者恢复期血浆样本进行性能确认。结果专属性:阳性样本及阴性样本均能被有效检出;检测限:1×LOD~2×LOD企业参考品19次检测开放阅读框1a/b和/或核衣壳蛋白基因为阳性;重复性和中间精密度:两种阳性对照基因以及内部质控在不同荧光通道的循环阈值的相对标准偏差均符合要求。性能确认:康复者恢复期血浆2019-nCoV核酸检测结果均为阴性。结论该检测方法专属性强、稳定可靠、重复性好,适用于COVID-19康复者恢复期血浆2019-nCoV核酸检测。

关键词：新型冠状病毒肺炎新型冠状病毒核酸检测恢复期血浆

COVID-19康复者恢复期血浆及COVID-19静注人免疫球蛋白的IgG亚类检测分析

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国际生物制品学杂志 2021年第4期44卷 181-185页

作者：邢延涛韩韧梁小龙曾双迎黄锡安彭焱高斌王霖慧周志军梅峰吴强喻剑虹胡勇何彦林李策生国药集团武汉血液制品有限公司血液制剂室 430207 国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部 430207 国药集团武汉血液制品有限公司质量控制室 430207 国药集团武汉血液制品有限公司 430207

目的探讨COVID-19康复者恢复期血浆及COVID-19静注人免疫球蛋白(human intravenous immunoglobulin,IVIG)(COVID-19-IVIG)IgG及亚类的水平。方法选择2020年2月至3月国药集团武汉血液制品有限公司采集的COVID-19康复者恢复期血浆及制备的COVID-19-IVIG作为研究组,选择健康者单采血浆及IVIG作为对照组。采用免疫比浊法检测并比较免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)及IgG亚类水平。分析COVID-19-IVIG中IgG亚类与其他蛋白之间的相关性。结果健康者单采血浆的IgG3、IgG4水平显著高于恢复期血浆(P0.05)。恢复期血浆IgM水平与血型〔相关系数(r)=0.649〕、抗体效价(r=0.696)呈正相关(P0.05)。在COVID-19-IVIG中,仅IgG2水平与α2巨球蛋白呈负相关(P<0.05)。结论恢复期血浆IgG亚类水平与健康者单采血浆有一定差异。COVID-19-IVIG制备过程中存在IgG亚类水平的变化,COVID-19-IVIG IgG亚类齐全,与IVIG IgG亚类水平相近。

关键词：新型冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆免疫球蛋白G 免疫球蛋白亚类