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基于猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的RT-RAA-LF检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2024年

作者：张紫薇马佳镁黄春媛于娜郑佳馨张艳刘光亮曹宗喜塔里木大学动物科学与技术学院新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室新疆农业大学动物医学学院海南省农业科学院畜牧兽医研究所海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室/国家动物疫病数据中心海口观测实验点苏州天隆生物科技有限公司海南省农业科学院三亚研究院(海南省实验动物研究中心)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害全球养猪业最重要的疾病之一，给世界范围内的养猪业带来了重大的经济损失。临床上快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是PRRS防控的关键因素。该研究建立了一种基于逆转录重组酶辅助扩增(RT-... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害全球养猪业最重要的疾病之一，给世界范围内的养猪业带来了重大的经济损失。临床上快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是PRRS防控的关键因素。该研究建立了一种基于逆转录重组酶辅助扩增(RT-RAA-LF)检测PRRSV的方法。该方法通过针对PRRSV ORF7基因序列设计特异性引物和探针。RT-RAA-LF检测可在39℃下用引物和探扩增10 min，通过侧流层析试纸条在3 min内用肉眼观察结果。该方法具有较高的灵敏度，最低检测限为101copies/μL，并且具有较强的特异性，与其他猪病原体无交叉反应。使用RT-RAA-LF和PCR检测157份样品，RT-RAA-LF与PCR方法的一致性χ2＜ 3.84，两种方法之间的符合率97.8%。上述结果表明，该研究成功建立了RT-RAA-LF检测方法，为PRRSV的快速和直观检测提供了一种新的方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 RAA ORF7 侧流层析试纸条快速检测

2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

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中国预防兽医学报 2024年第5期46卷 468-475页

作者：董志民李秀丽杨春蕾杨丽景田向学王利丽池晶晶张莉孟乐张万江祝瑶张东超鄢明华天津市农业科学院畜牧兽医研究所/天津市畜禽分子育种与生物技术重点实验室/天津市畜禽健康养殖工程技术中心天津300381 国家动物疫病天津观测实验点天津300381 天津市农业科学院农产品质量安全与营养研究所天津300381 天津市宁河原种猪场有限公司天津301506 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定... 详细信息

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性。结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h~15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107cfu/mL。进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2368195 bp,GC含量40.88%,含有2299个编码基因,其中有1822、1830和1077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S r RNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等。本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据。

关键词：猪链球菌2型分离鉴定致病力遗传特征

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

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中国家禽 2024年第5期46卷 118-124页

作者：刘颖昳胡迪刘倩倩迟盛仁刘琳王传彬顾小雪中国动物疫病预防控制中心北京102618

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果... 详细信息

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

关键词：禽白血病病毒净化 ELISA p27抗原

基于Nrf2/HO-1启动子筛选抗水生病毒药物的方法

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水产学报 2024年第2期48卷 143-154页

作者：王靖雯吴苗苗李莉娟顾泽茂袁军法华中农业大学水产学院华中农业大学水生动物疫病专业实验室

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法，实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料，构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒，利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲... 详细信息

为建立基于Nrf2、HO-1启动子活性的抗病毒药物筛选方法，实验以胖头鱥上皮细胞系(FHM)为材料，构建Nrf2、HO-1启动子重组质粒，利用双荧光素酶报告系统检测不同浓度(0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μg/mL)的白藜芦醇、水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素对启动子活性的影响，并利用鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)和蛙虹彩病毒(rana grylio iridovirus,RGV)验证阳性药物的抗病毒效果。结果显示，Nrf2、HO-1启动子序列中存在FOX家族、IRF家族等多种转录因子的结合位点，并分别存在1个和3个与甲基化相关的CpG岛。双荧光素酶报告实验显示，水飞蓟宾、穿心莲内酯及姜黄素可激活Nrf2、HO-1启动子。药物浓度梯度实验显示，6.3μg/mL的姜黄素和穿心莲内酯可显著上调Nrf2和HO-1的启动子活性。病毒感染后的细胞病变效应、病毒的复制及病毒滴度结果均表明姜黄素和穿心莲内酯可抑制SVCV和RGV的感染。综上，本实验建立的pGL3-Nrf2和pGL3-HO-1启动子报告质粒，可用于抗水生病毒药物的筛选，也为Nrf2、HO-1转录调控机制的研究提供了工具。

关键词：水生病毒胖头鱥上皮细胞(FHM) Nrf2 HO-1 启动子抗病毒药物筛选

羊肺炎支原体感染对贵州不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平的影响

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 26-35页

作者：李梅杨源王军陈静杨鹏成虹松岳筠张双翔程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008

羊肺炎支原体(Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体肺炎。本研究旨在分析Mo感染对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)MyD88通路因子基因转录水平的影响,进而分析不同品种羊对Mo感染的差异性。本研究以Mo人工感染贵州5个主要品种羊,应用TaqMan RT... 详细信息

羊肺炎支原体(Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体肺炎。本研究旨在分析Mo感染对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)MyD88通路因子基因转录水平的影响,进而分析不同品种羊对Mo感染的差异性。本研究以Mo人工感染贵州5个主要品种羊,应用TaqMan RT-qPCR方法对不同品种试验羊肺脏和血液样本TLRs MyD88通路因子基因转录水平进行定量检测与分析。结果显示,不同品种羊感染Mo后,MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS、JUN基因mRNA相对表达量均显著上调(P<0.01)。同时发现,感染死亡的贵州黑山羊、贵州白山羊血液和肺脏样本中MyD88、FOS基因转录水平上调倍数均显著高于感染未死亡的波尔山羊、湖羊(P<0.05);感染未死亡的波尔山羊血液中NF-κB基因转录水平上调倍数均极显著高于其余四种羊(P<0.01),这种差异表达出现的原因可能是Mo对不同品种羊的致病机理不同。以上研究结果表明,贵州不同品种羊对Mo的易感程度与TLRs MyD88通路因子转录水平有关,为研究Mo对于不同品种羊的致病机制提供基础研究资料。

关键词：羊肺炎支原体 Toll样受体 MyD88通路因子转录分析

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鸡毒支原体P31蛋白原核表达及膜定位鉴定

中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 85-90页

作者：李梅杨美岳筠王柏林宋春朱二鹏单春兰文明程振涛贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008

为筛选鸡毒支原体(MG)膜蛋白,利用生物信息学软件对其进行序列分析后,选择不含跨膜区的714 bp基因片段作为靶标蛋白进行原核表达(因其分子量约31 kDa,故而命名为P31蛋白),表达P31蛋白并进行纯化后制备兔多克隆抗体,运用ELISA方法检测抗... 详细信息

为筛选鸡毒支原体(MG)膜蛋白,利用生物信息学软件对其进行序列分析后,选择不含跨膜区的714 bp基因片段作为靶标蛋白进行原核表达(因其分子量约31 kDa,故而命名为P31蛋白),表达P31蛋白并进行纯化后制备兔多克隆抗体,运用ELISA方法检测抗体效价,提取MG液体培养物总蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白,利用Western blot进行亚细胞定位。结果显示,P31蛋白具有跨膜结构和良好的B细胞抗原表位,原核表达后获取融合蛋白rP31,大小约为31 kDa,ELISA检测兔血清效价为1∶25600,Western blot分析显示,rP31蛋白分布在MG膜表面。本研究证实了P31蛋白确为MG膜蛋白且抗原性良好,可做为研发MG新型诊断方法、基因工程疫苗及治疗药物的候选蛋白。

关键词：鸡毒支原体 P31蛋白原核表达膜定位

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免疫代谢物衣康酸对不同疾病调控作用及其作用机制研究进展

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生物工程学报 2024年

作者：程钟坤赵静贤刘言言徐凌赵光伟倪兴维杨晓伟西南大学动物医学院贵州省动物疫病预防控制中心

衣康酸(itaconate)是免疫细胞三羧酸(tricarboxylic acid， TCA)循环的一种重要中间代谢物，由免疫应答基因1(immune response gene 1， IRG1)编码的乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase1， ACOD1)催化顺乌头酸脱羧产生。2011年，研究人员发现在LPS刺激小鼠巨噬细胞中衣康酸显著升高。此后作为新发现的代谢物，衣康酸成为免疫代谢学的研究热点。研究发现衣康酸通过调控炎症、重塑细胞代谢和参与遗传调控等方式在不同疾病中发挥重要调控作用。本文将从衣康酸的结构、对不同疾病调控作用及其作用机制这3个方面，综述衣康酸的研究进展。

关键词：衣康酸免疫代谢物炎症细胞代谢遗传调控

西藏牦牛源牛支原体T10株全基因组测序及其序列分析

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2154-2167页

作者：罗婷韩徐业芬蔡林索朗斯珠徐晋花牛家强西藏农牧学院动物科学学院、西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室林芝860000

旨在进一步完善牛支原体全基因组数据库,阐明其生物学功能和遗传进化关系,对西藏牦牛源牛支原体T10株进行了全基因组测序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150测序平台对T10株进行全基因组序列测定,利用生物信息学对其进行基因... 详细信息

旨在进一步完善牛支原体全基因组数据库,阐明其生物学功能和遗传进化关系,对西藏牦牛源牛支原体T10株进行了全基因组测序及其序列分析。使用Nanopore和Illumina PE150测序平台对T10株进行全基因组序列测定,利用生物信息学对其进行基因组特征分析和利用基因系统进化树与国内外分离株进行遗传进化关系比对。基因测序结果显示,T10株全基因组大小为987 812 bp, GC含量为29.27%,预测到822个编码基因,编码基因总长度为709 129 bp;通过功能数据库注释结果显示,注释到与膜转运蛋白相关基因22个,碳水化合物酶相关基因7个、糖基转移酶类相关基因4个,分泌蛋白基因相关43个、T3SS效应蛋白相关基因51个,病原与宿主互作相关基因28个,细菌毒力相关基因14个,抗性相关基因10个;通过比较基因组学分析结果显示,T10与08M、CQ-W70、Hubei-1、Ningxia-1和PG45均存在氨基酸突变和基因片段的插入或缺失,以及基因家族数量的差异,其中基因家族数量差异在8~32个。通过遗传进化关系分析结果显示:T10与HB0801、16M、Hubei-1、CQ-W70、NM2012、Ningxia-1、08M、JF4278、KG4397和PG45均在同一分支,但与PG1、PG2处于不同分支,其中与HB0801亲缘关系最近,与PG45亲缘关系较远。本研究不仅完善了牛支原体全基因组数据库,详细阐述了与致病性相关基因,还充分阐明了T10株以及与国内外其他牛支原体之间的遗传进化关系,明确了T10株基本基因组信息以及与国内外菌株亲缘关系,为后续进行致病机制以及疫苗研究提供理论依据。

关键词：牦牛牛支原体全基因组测序基因功能注释比较基因组

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副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

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中国农业科学 2024年第6期57卷 1204-1214页

作者：陈凡若张嘉俊鹿萍崔宁崔莹莹崔子寅党光辉刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营... 详细信息

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失，并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善，现有的PTB疫苗保护效果不佳，并且干扰牛结核病的诊断，因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因，分别构建5种重组质粒，在获得5种重组蛋白基础上，联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠，通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原；随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合，经皮下多点注射免疫小鼠，在二免3周后用1×108CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γ ELISPOT试验，抗体监测和细胞因子检测，分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异，综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F，其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高，是更具潜力的候选免疫原，且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平，诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放；在保护效果评价中，融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降，显著减轻肝脏的病理损伤，降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应，对MAP感染有着一定免疫保护作用，是PTB重要的候选亚单位疫苗。

关键词：副结核分枝杆菌亚单位疫苗 58F蛋白免疫评价