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MKK6过表达调控SIRT1影响食管癌细胞肿瘤行为学的体外研究

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四川大学学报（医学版） 2015年第4期46卷 548-553页

作者：杨晓龙胡开锋刘明佳任朋亮陈利弘刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的向食管癌Eca109细胞中转染pcDNA3.1(+)/myc-His A-丝裂原活化蛋白激酶6(MKK6)重组过表达载体,观察过表达MKK6影响沉默信息转录调控因子(SIRT1)表达后肿瘤细胞增殖、凋亡以及侵袭力发生的变化,探讨p38-MAPK-SIRT1调节轴的存在性及其... 详细信息

目的向食管癌Eca109细胞中转染pcDNA3.1(+)/myc-His A-丝裂原活化蛋白激酶6(MKK6)重组过表达载体,观察过表达MKK6影响沉默信息转录调控因子(SIRT1)表达后肿瘤细胞增殖、凋亡以及侵袭力发生的变化,探讨p38-MAPK-SIRT1调节轴的存在性及其对Eca109细胞各项肿瘤行为学造成的影响。方法根据GenBank中MKK6基因的mRNA序列设计引物,构建MKK6过表达载体;将Eca109细胞分空载体转染组、MKK6过表达载体转染组、MKK6-SIRT1ShRNA共转染组和MKK6-RES(白藜芦醇)组,相应处理后,采用Western blot测定各组Eca109细胞的SIRT1及MKK6表达水平,MTT法检测各组Eca109细胞的增殖活力,Transwell法观察各组Eca109细胞的侵袭力,流式细胞术检测各组Eca109细胞的凋亡情况。结果测序结果表明成功构建MKK6过表达载体;转染MKK6过表达载体可降低Eca109细胞的内源性SIRT1表达,减弱Eca109细胞的增殖活力,促其凋亡,同时可使Eca109细胞的侵袭力增强,以上各项改变均与SIRT1的表达水平有关。结论Eca109细胞内可能存在p38-MAPK-SIRT1调节轴,MKK6及其下游因子对SIRT1可能具有反馈调节作用,可引起Eca109细胞各项肿瘤行为学的变化。

关键词： MKK6 SIRT1 Eca109细胞细胞活力细胞侵袭力细胞凋亡反馈调节轴

过氧化氢诱导的人正常和早老细胞中DNA损伤及其修复研究

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四川大学学报（医学版） 2011年第5期42卷 610-615页

作者：所起凤杜文婷杨鸣鸣范雪娇刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究人早老细胞和正常衰老细胞在氧化应激条件下的DNA损伤和修复。方法采用免疫荧光技术和彗星电泳技术,分别检测3组不同群体倍增数(PD)的人正常二倍体成纤维细胞BJ(青年组第14代,成年组第30代,衰老组第45代)和2组不同PD的人赫-吉... 详细信息

目的研究人早老细胞和正常衰老细胞在氧化应激条件下的DNA损伤和修复。方法采用免疫荧光技术和彗星电泳技术,分别检测3组不同群体倍增数(PD)的人正常二倍体成纤维细胞BJ(青年组第14代,成年组第30代,衰老组第45代)和2组不同PD的人赫-吉二氏综合征(HGPS)细胞(青年组第8代,衰老组第17代)的DNA基础损伤程度。研究过氧化氢诱导造成以上细胞组DNA损伤及去除致损因素正常培养后的修复水平,采用免疫荧光和彗星电泳技术检测细胞在沉默DNA损伤修复蛋白着色性干皮病蛋白A(XPA)表达前后的修复能力。结果 BJ细胞衰老组DNA损伤程度较高,与成年组相比,对DNA损伤诱导因子更加敏感(P基础损伤程度即已达到衰老BJ细胞类似或更高水平,且与BJ细胞具有一致的DNA损伤年龄变化趋势。经siRNA沉默XPA表达后可部分恢复HGPS细胞的修复能力,对BJ细胞则没有影响。随年龄增长无论正常还是早老细胞,DNA损伤程度增加,修复效率降低。结论 XPA功能异常抑制了HGPS细胞的损伤修复。

关键词：彗星电泳免疫荧光过氧化氢 DNA损伤 DNA修复

过表达miR-18a靶向ATM对结肠癌细胞增殖和迁移的影响

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四川大学学报（医学版） 2016年第4期47卷 451-457页

作者：刘明佳陈利弘胡开锋杨晓龙董婧颖刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究miR-18a通过靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated gene,ATM)调控结肠癌细胞的生物学特性。方法通过软件预测miR-18a其中一个靶基因。设计合成miR-18a的模拟剂(mimics)和抑制剂(inhibitor),通过... 详细信息

目的研究miR-18a通过靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated gene,ATM)调控结肠癌细胞的生物学特性。方法通过软件预测miR-18a其中一个靶基因。设计合成miR-18a的模拟剂(mimics)和抑制剂(inhibitor),通过转染不同组分上调或下调内源性miR-18a在结肠癌细胞株HCT116中的表达。采用实时荧光定量(qRT)-PCR、Western blot、MTT法、克隆形成实验、Transwell等方法,检测过表达miR-18a调控ATM基因的表达对体外结肠癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果软件预测发现miR-18a的其中一个靶基因是ATM。通过瞬时转染,过表达内源性miR-18a,可降低HCT116细胞内靶基因ATM蛋白的表达水平。转染miR-18amimics后能够下调HCT116细胞的增殖活力,同时显著降低HCT116细胞的克隆形成能力、横向迁移能力及纵向侵袭能力,以上各项改变均与miR-18a过表达有关。结论证实了miR-18a通过负向调控ATM的表达,抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和迁移能力。

关键词： miR-18a ATM 增殖迁移结肠癌细胞 HCT116

microRNA启动子区甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响

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四川大学学报（医学版） 2019年第2期50卷 182-187页

作者：彭恒董婧颖赵亚楠吴文兵杨晓龙陈丹胡开锋陈利弘刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs(miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a)表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-... 详细信息

目的研究microRNA启动子区甲基化水平的变化对几种microRNAs(miRNA34a、miRNA34b、miRNA148a、miRNA203a)表达的影响,并进一步研究该甲基化调控对人肺癌细胞A549增殖、迁移以及侵袭能力的影响。方法不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理人肺癌细胞A549,分别作用24 h、48 h、72 h,采用CCK8法检测细胞增殖情况,计算增殖抑制率。20μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h,通过甲基化特异性PCR(MSP)检测A549细胞相关miRNAs启动子甲基化水平的变化;实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测A549细胞相关miRNAs表达水平的变化。20μmol/L 5-Aza-CdR处理A549细胞0 h、24 h、48 h,采用划痕实验检测细胞迁移能力(计算细胞在24 h和48 h的划痕愈合率);作用48 h,采用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 CCK8结果显示,随着5-Aza-CdR的处理浓度升高、时间延长,A549细胞的增殖抑制率逐渐增加。经5-Aza-CdR去甲基化处理后,MSP结果表明,实验组相对于对照组甲基化引物扩增条带减弱,而非甲基化引物扩增条带增强;Real-time PCR结果显示,相关miRNAs表达水平升高(P室滤膜下表面的细胞数亦减少(P<0.05)。结论人肺癌细胞A549经5-Aza-CdR去甲基化处理后,miRNAs表达水平升高,进一步抑制肺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。

关键词：肺癌A549细胞株 microRNA 甲基化增殖迁移侵袭

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肝脏在高甘油三酯血症中的作用

生理科学进展 2005年第2期36卷 166-169页

作者：崔晓燕方定志四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

高甘油三酯血症(HTG)是心脑血管疾病的独立危险因子。肝脏在甘油三酯的合成和分解代谢过程中起着十分重要的作用,肝脏甘油三酯合成过剩或/和甘油三酯分解障碍,均能使血浆甘油三酯升高,形成HTG。肝脏甘油三酯合成过剩的因素包括一些参与... 详细信息

高甘油三酯血症(HTG)是心脑血管疾病的独立危险因子。肝脏在甘油三酯的合成和分解代谢过程中起着十分重要的作用,肝脏甘油三酯合成过剩或/和甘油三酯分解障碍,均能使血浆甘油三酯升高,形成HTG。肝脏甘油三酯合成过剩的因素包括一些参与甘油三酯合成的酶活性增加;甘油三酯分解代谢延缓的因素包括Angptl3和肝脏X受体(LXR)功能加强,肝脂酶活性受抑制,ApoE2 和ApoCIII含量升高;既能使甘油三酯合成增加,也能使甘油三酯分解代谢延缓的因素包括餐后,ApoAⅡ与胆固醇酯转移蛋白(CETP)的协同作用等。

关键词：肝脏高甘油三酯血症极低密度脂蛋白乳糜微粒

天然及氧化修饰高密度脂蛋白对内皮细胞部分分泌功能的影响

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四川大学学报（医学版） 2005年第5期36卷 637-640页

作者：李宏汤慧方定志刘秉文四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究天然高密度脂蛋白(N-HDL)及氧化修饰高密度脂蛋白(OX-HDL)对培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)部分分泌功能的影响。方法采用培养人脐静脉内皮细胞,以0.01mol/LPBS为空白对照,以N-HDL为正常对照,分别加入不同质量浓度OX-HDL(5mg/L,10... 详细信息

目的研究天然高密度脂蛋白(N-HDL)及氧化修饰高密度脂蛋白(OX-HDL)对培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)部分分泌功能的影响。方法采用培养人脐静脉内皮细胞,以0.01mol/LPBS为空白对照,以N-HDL为正常对照,分别加入不同质量浓度OX-HDL(5mg/L,10mg/L,50mg/L)共同孵育24h后,观察培养基中内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)水平的变化。结果和空白对照相比,N-HDL组NO的量(P学意义(P均>0.05);OX-HDL组NO的量和NOS活性均显著下降,并呈剂量依赖关系,PAI-1活性也显著升高(P学意义。结论N-HDL可以明显提高培养人脐静脉内皮细胞分泌NO的量并提高NOS活性,对tPA和PAI-1的产生则没有显著影响;而OX-HDL明显抑制内皮细胞NO合成和NOS活性,它不影响tPA的水平,却增加内皮细胞PAI-1活性。

关键词：高密度脂蛋白氧化修饰内皮细胞一氧化氮合酶纤溶酶原激活物抑制剂

ACE基因I/D多态性对高糖低脂膳食诱导的健康青年血脂比值及血压变化的影响

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四川大学学报（医学版） 2013年第5期44卷 731-735页

作者：张荣荣宋永燕樊梅李元昊姜喆张珍方定志四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因16内含子插入/缺失(I/D)多态性对高糖低脂(HC/LF)膳食诱导的健康汉族青少年血脂比值及血压变化的影响。方法 56名健康青年志愿者,给予7d平衡膳食和6d HC/LF膳食,分别于第1d、第8d和第14d清晨抽取空腹... 详细信息

目的探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因16内含子插入/缺失(I/D)多态性对高糖低脂(HC/LF)膳食诱导的健康汉族青少年血脂比值及血压变化的影响。方法 56名健康青年志愿者,给予7d平衡膳食和6d HC/LF膳食,分别于第1d、第8d和第14d清晨抽取空腹静脉血,测定血压和血脂水平并计算血脂比值。聚合酶链式反应检测ACE基因16内含子I/D多态性。结果在整体受试人群及性别分层各组中,基础值、HC/LF膳食前、HC/LF膳食后的血脂比值及血压水平在Ⅱ基因型与D等位基因携带者(ID+DD基因型)之间均无统计学差异。与HC/LF膳食前相比,在整体受试人群中,HC/LF膳食后低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇(LDLC/HDL-C)和总胆固醇(TC)/HDL-C在两组基因型受试者中均降低;收缩压(SBP)仅在Ⅱ基因型受试者中降低。性别分层分析发现,HC/LF膳食后甘油三酯(TG)/HDL-C和log(TG/HDL-C)仅在女性Ⅱ基因型受试者中升高,TG/HDL-C和log(TG/HDL-C)仅在男性Ⅱ基因型受试者中降低;TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C在所有男性受试者和女性D携带者中降低;SBP仅在男性D携带者中降低。结论 HC/LF与ACE基因16内含子I/D多态性I等位基因相互作用可降低男性TG/HDL-C和log(TG/HDL-C)、升高女性TG/HDL-C和log(TG/HDL-C);与D等位基因相互作用可降低男性收缩压、女性TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C。

关键词：血管紧张素转换酶基因多态性血脂比值血压高糖低脂膳食

甲基化调控microRNA表达影响胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究

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四川大学学报（医学版） 2017年第6期48卷 819-823页

作者：胡开锋杨秋韵董婧颖杨晓龙彭恒陈利弘孙艺马兰枝刘戟四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的研究基因启动子区甲基化对胰腺癌相关microRNA(miR34a、miR34b、miR148a、miR203a)表达水平的调控,及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法通过5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)去甲基化处理胰腺癌细胞MIAPaca-2,使用甲... 详细信息

目的研究基因启动子区甲基化对胰腺癌相关microRNA(miR34a、miR34b、miR148a、miR203a)表达水平的调控,及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法通过5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)去甲基化处理胰腺癌细胞MIAPaca-2,使用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测60μmol/L5-Aza-CdR处理组及0μmol/L对照组MIAPaca-2细胞目标microRNA启动子甲基化水平的变化;用荧光实时定量PCR检测处理组及对照组目标microRNA表达水平的改变;CCK-8法、划痕实验以及Transwell法检测胰腺癌细胞去甲基化处理后处理组和对照组增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果 MSP法结果显示处理组较未处理组目标microRNA甲基化M条带灰度值减弱,非甲基化U条带灰度值增强,处理组目标microRNA启动子甲基化程度较对照组减弱。荧光实时定量PCR结果显示处理组较未处理组目标microRNA相对表达量升高(P<0.05),处理组microRNA的表达水平随去甲基化处理而升高。CCK-8法显示随着药物处理浓度的增加,处理组细胞抑制率增高,去甲基化处理抑制了胰腺癌细胞的增殖能力。划痕实验结果显示处理组较未处理组细胞伤口愈合率降低(P<0.01),去甲基化处理降低了胰腺癌细胞的迁移能力。Transwell法结果显示处理组较未处理组穿膜细胞数减少(P<0.01),去甲基化处理降低了胰腺癌细胞的侵袭能力。结论肿瘤细胞去甲基化处理,导致4种目标microRNA高表达,抑制了胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

关键词： microRNA 甲基化 5-Aza-CdR 胰腺癌增殖迁移

CDP抑制乳腺癌细胞T47D生长及逆转p16基因甲基化的研究

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四川大学学报（医学版） 2004年第6期35卷 792-796页

作者：徐丹覃扬孙芝琳孙泽芳四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的　研究 CDP(一种中药成分 )抑制乳腺癌 T4 7D细胞株生长的机制。方法　不同浓度的 5 -氮杂胞苷 (5 - azacytidine,5 - aza- CR)或 CDP与 T4 7D细胞培养数天 ,细胞增殖试验 (MTT法 )检测对 T4 7D细胞生长的影响 ;流式细胞术检测凋亡... 详细信息

目的　研究 CDP(一种中药成分 )抑制乳腺癌 T4 7D细胞株生长的机制。方法　不同浓度的 5 -氮杂胞苷 (5 - azacytidine,5 - aza- CR)或 CDP与 T4 7D细胞培养数天 ,细胞增殖试验 (MTT法 )检测对 T4 7D细胞生长的影响 ;流式细胞术检测凋亡峰和细胞周期改变 ;甲基化特异性 PCR(MSP)检测用药前后 p16基因甲基化、非甲基化状态及程度的改变。结果　 5 - aza- CR和 CDP均对细胞生长呈浓度和时间依赖性抑制作用 (P<0 .0 5 ) ;在试验药物浓度 5 - aza- CR2 μm ol/ L,CDP5 0 μm ol/ L 的作用下 ,对细胞生长周期有影响 :G0 / G1 期细胞数由 6 5 .1%增加到71.3%和 84 .3% ,S期细胞数由 19.4 %减少到 14 .3%和 7.2 % ;药物作用细胞 6 d后对 p16基因有完全去甲基化作用。结论　 CDP可以逆转 p16基因高甲基化 ,并可能因此抑制肿瘤细胞生长。

关键词： CDP 5-氮杂胞苷乳腺癌 p16基因甲基化特异性PCR