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利用CRISPR/Cas9技术创制黄果番茄新种质

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农业生物技术学报 2024年第7期32卷 1693-1702页

作者：龙海成马燕勤周玉洁常伟李菊李志苗明军杨亮四川省农业科学院园艺研究所蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室/农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室四川农业大学资源学院四川省蔬菜工程技术研究中心四川省食用菌研究所

目前国内市场上优异黄果番茄(Solanum lycopersicum)品种相对稀缺，为了满足市场需求，提高种业竞争力，本研究以'MoneyMaker'('MM')番茄为材料，利用CRISPR/Cas9技术，对番茄八氢番茄红素合成酶1 (phytoene synthase 1, SlPSY1)基因(So... 详细信息

目前国内市场上优异黄果番茄(Solanum lycopersicum)品种相对稀缺，为了满足市场需求，提高种业竞争力，本研究以'MoneyMaker'('MM')番茄为材料，利用CRISPR/Cas9技术，对番茄八氢番茄红素合成酶1 (phytoene synthase 1, SlPSY1)基因(Solyc03g031860)进行定向基因编辑来创制黄色果实番茄。选择SlPSY1基因外显子区域2个序列特异的sgRNA作为靶位点，构建CRISPR/Cas9双元表达载体p KSE401，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘转化法对'MM'番茄材料进行遗传转化。结果显示，16株再生苗中鉴定出了12株阳性转基因植株，阳性转化率为75%；对阳性转基因植株的靶位点测序分析发现，有8株在2个靶位点上共发生21次编辑事件，基因编辑效率为66.7%，且均未发生脱靶现象；获得的突变植株中有5株在成熟期果实表现为黄色。本研究利用CRISPR/Cas9技术在'MM'番茄上成功创制了SlPSY1基因编辑材料，为今后快速创制番茄黄果资源提供技术及材料基础。

关键词：番茄 CRISPR/Cas9 八氢番茄红素合成酶1(PSY1) 基因编辑黄果番茄

畜禽肌纤维发育相关细胞种类及鉴定方法的研究进展

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畜牧兽医学报 2024年

作者：吴丹妮谢遇春秦箐张崇妍徐晓龙赵丹兰茗熙杨继徐松松刘志红内蒙古农业大学河北科技师范学院中国农业大学农业农村部肉羊遗传育种重点实验室内蒙古自治区羊遗传育种与繁殖重点实验室

肌细胞（又名肌纤维）是组成骨骼肌的基本单位，约占畜禽机体的50%左右，与畜禽产肉性能、骨骼保护密切相关，对调节畜禽机体代谢和内分泌有重要作用，同时也为畜禽的运动提供了动力。骨骼肌是一种较为复杂的组织，而组成这些组织的基... 详细信息

肌细胞（又名肌纤维）是组成骨骼肌的基本单位，约占畜禽机体的50%左右，与畜禽产肉性能、骨骼保护密切相关，对调节畜禽机体代谢和内分泌有重要作用，同时也为畜禽的运动提供了动力。骨骼肌是一种较为复杂的组织，而组成这些组织的基本单位是肌细胞，骨骼肌在发育时期需要多种类型的单核和多核细胞相互作用，这是形成优质肉类的关键。近些年，随着科学技术的快速发展，对鉴定骨骼肌发育相关细胞有了更多种且全面的技术，而单细胞测序技术在其中运用的最为广泛，它的运用对组成骨骼肌的细胞类型和相关细胞发育异质性的研究提供了技术支持，对肉品质的研究有重大意义。本文综述了通过细胞形态学观察、分子标记物、免疫组化、免疫荧光、原位杂交、单细胞测序的方法鉴定与骨骼肌发育过程相关的细胞，归纳与骨骼肌发育相关细胞的标记基因，为了解骨骼肌的结构和功能，为探索骨骼肌发育机制提供参考，为肉品质的研究提供理论基础，也在不同品种的个体选育中具有重要意义和实践价值。

关键词：骨骼肌骨骼肌发育细胞鉴定

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一株猪流行性腹泻病毒强毒株的分离与鉴定

畜牧兽医学报 2024年第7期55卷 3049-3063页

作者：刘维哲罗成刚袁蓉廖艺杰文艺悯孙莹俞恩波曹三杰黄小波四川农业大学动物医学院猪病研究中心成都611130 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站成都611130 成都市畜禽遗传资源保护中心成都610081

为了掌握猪流行性腹泻病毒(PEDV)最新流行毒株的病原特征与致病性,开展了PEDV的分离与鉴定。将PEDV阳性病料样品接种Vero细胞连续盲传,分离PEDV流行毒株,并开展了分离毒株的培养特性、全基因组序列分析和仔猪致病性评价。结果显示:传至... 详细信息

为了掌握猪流行性腹泻病毒(PEDV)最新流行毒株的病原特征与致病性,开展了PEDV的分离与鉴定。将PEDV阳性病料样品接种Vero细胞连续盲传,分离PEDV流行毒株,并开展了分离毒株的培养特性、全基因组序列分析和仔猪致病性评价。结果显示:传至第3代(P3)分离出一株病毒,病毒在细胞上形成典型的“合胞体”样病变;电镜下病毒大小60~110 nm;P10到P35代滴度从10^(4.7)TCID_(50)·mL^(-1)升至10^(6.43)TCID_(50)·mL^(-1);CHN-SC2021(P5)基因组全长28014 bp(GenBank收录号:OM505025.1),与中国地区、欧美地区、亚洲其他国家毒株的相似性分别为99.16%~96.32%、99.01%~96.57%、98.94%~96.33%;系统进化树显示CHN-SC2021株与江西CH/JXJA/2017(MF375374.1)、河南CH/HNAY/2015(KT199103.1)、CH/HNKF-16(KY649107.1)毒株亲缘关系较近,属于GⅡa型毒株。S基因序列与参考毒株相似度在98.7%~93.4%。将CHN-SC2021病毒液以每头3 mL 10~5 TCID_(50)·mL^(-1)的剂量口服感染6日龄哺乳仔猪,12 h开始出现食欲不振,20 h时呕吐,24 h出现剧烈呕吐和黄色水样腹泻;剖检病变主要是胃肠臌气、空肠和回肠透明;组织病变显示各肠段均有不同程度的肠绒毛病变、脱落、结缔组织疏松、黏膜肌层与肌层间距增宽等;免疫组化结果显示小肠各段均有病毒,回肠中病毒最多。本研究分离获得一株GⅡa型的PEDV强毒株,有助于丰富我国PEDV的流行毒株信息及为临床防控提供参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒分离鉴定序列分析哺乳仔猪致病性

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2款猪液相芯片性能比较分析

现代畜牧科技 2024年第1期 1-5页

作者：王俊戈崔晟頔陈子旸申琦余杨陈栋赵真坚王书杰吴平先郭宗义王金勇唐国庆四川农业大学动物科技学院猪禽种业全国重点实验室农业农村部畜禽生物组学重点实验室畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室四川成都610000

目的:比较30K液相芯片和50K液相芯片的性能。方法:该研究收集共322头纯种大白猪和杜洛克猪的生长性能测定记录,使用30K液相芯片和50K液相芯片对其中177头进行基因组分型,用358头大白猪、长白猪和杜洛克猪的重测序数据作为填充参考群体... 详细信息

目的:比较30K液相芯片和50K液相芯片的性能。方法:该研究收集共322头纯种大白猪和杜洛克猪的生长性能测定记录,使用30K液相芯片和50K液相芯片对其中177头进行基因组分型,用358头大白猪、长白猪和杜洛克猪的重测序数据作为填充参考群体进行填充,分析2款芯片的填充效果,利用2款芯片的原始和填充数据对日增重、日采食量和饲料转化率进行全基因组关联分析,并对比3个性状的GWAS结果。结果:30K液相芯片的参考填充准确率高于50K液相芯片,50K液相芯片的自填充GWAS分析结果优于30K液相芯片,而参考填充GWAS分析效果,50K液相芯片发现位点较多,但整体情况30K液相芯片较好。结论:30K液相芯片在分析过程中具有整体上的优势。

关键词：猪液相芯片基因型填充基因组关联分析

HDACi和RS-1提高CRISPR/Cas12i介导的HDR编辑效率

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农业生物技术学报 2024年第10期32卷 2306-2323页

作者：陈秋崇李尚朴苗洱钰周冰倩王旭孟祥宇王小龙徐坤西北农林科技大学动物科技学院/农业农村部动物生物育种国际联合研究中心/陕西省动物遗传育种与繁殖重点实验室

CRISPR/Cas12i是我国学者新近开发的、具有自主知识产权的CRISPR基因编辑系统，被证实具有不亚于CRISPR/Cas9系统的打靶效率。同源定向修复（homology-directed repair, HDR）是DNA双链断裂（double-stranded break, DSB）的主要修复方... 详细信息

CRISPR/Cas12i是我国学者新近开发的、具有自主知识产权的CRISPR基因编辑系统，被证实具有不亚于CRISPR/Cas9系统的打靶效率。同源定向修复（homology-directed repair, HDR）是DNA双链断裂（double-stranded break, DSB）的主要修复方式之一。基于HDR机制的基因编辑可用于纠正基因组中任何形式的突变，但受限于哺乳动物细胞中普遍较低的HDR效率。本研究首先通过单链复性（single-strand annealing, SSA）报告试验、剂量梯度和浓度梯度实验分别验证CRISPR/Cas12i系统在人（Homo sapiens）胚肾细胞系HEK293T中不同靶点的活性、介导HDR编辑的单链寡核苷酸（single-stranded oligonucleotides,ssODN）供体模板剂量及添加小分子药物的适宜浓度，进而通过流式细胞分选、基因组PCR、Sanger测序和在线预测等手段，检测添加不同小分子药物对HEK293T细胞和绵羊（Ovis aries）胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率的影响。结果显示，CRISPR/Cas12i系统在HEK293T细胞18个不同靶点均表现出较高编辑活性，除2个位点稍低外，其余均在80%左右；不同剂量及长度的ss ODN对HDR效率有一定影响，且小分子药物适宜浓度在不同物种和不同类型细胞中略有不同；组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）和RS-1 (C20H16Br2N2O3S)对HEK293T细胞和绵羊胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率均有显著提升，其中RS-1细胞毒性最小，且在提升HDR效率同时未显著降低插入/缺失突变（insertion/deletion mutation, InDel）效率；此外，Entinostat作为HDACi之一，在绵羊胎儿成纤维细胞的骨形态发生蛋白受体1B （bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B）基因相关位点提升HDR编辑效率约148倍。总之，CRISPR/Cas12i系统具有较高编辑活性，能够在模式细胞和绵羊原代细胞中介导有效的、以ssODN为供体的HDR精确编辑，且适宜浓度的HDACi和RS-1可以有效提高HDR编辑效率。本研究为CRISPR/Cas12i基因编辑系统的推广与应用提供了参考和借鉴。

关键词： CPRISPR/Cas12i 同源重组 RS-1 (C20H16Br2N2O3S) 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi) 绵羊

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2023年成都地区猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传进化分析

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中国畜牧兽医 2024年第10期51卷 4531-4539页

作者：黄云川范磊林鑫雷玉王兴丽徐志文岳建国成都市动物疫病预防控制中心成都610041 四川农业大学动物医学院成都611130

【目的】调查分析成都地区猪圆环病毒3型(PCV3)的流行与分子遗传进化情况。【方法】试验于2023年1月至2023年12月从成都地区4家无害化处置场采集病死猪组织样品2113份,采用实时荧光定量PCR法检测病料组织PCV3感染情况。设计3对引物对阳... 详细信息

【目的】调查分析成都地区猪圆环病毒3型(PCV3)的流行与分子遗传进化情况。【方法】试验于2023年1月至2023年12月从成都地区4家无害化处置场采集病死猪组织样品2113份,采用实时荧光定量PCR法检测病料组织PCV3感染情况。设计3对引物对阳性样品的PCV3基因组序列进行PCR扩增并测序。通过在线软件拼接PCV3基因组序列、截取ORF2基因序列并推导其氨基酸序列(Cap),进行相似性比对并构建遗传进化树,分析Cap氨基酸序列突变情况。【结果】组织病料检测结果显示,2113份病死猪组织样品的PCV3阳性率为27.21%(575/2113)。根据PCR扩增测序结果拼接获得了15株PCV3基因组序列。相似性比对分析显示,15株PCV3核苷酸序列相似性为97.2%~100%,ORF2基因核苷酸序列相似性为97.2%~100%,Cap氨基酸序列相似性为96.7%~100%。遗传进化树结果显示,12株PCV3属于PCV3a亚型,3株属于PCV3c亚型。15株Cap氨基酸序列中共13株发生了突变,共存在13个突变位点。【结论】成都地区PCV3主要为PCV3a和PCV3c亚型,基因组相似性高,序列较保守,Cap氨基酸突变位点主要集中在抗原表位。本试验结果提示该地区需制定科学的防控政策,防止病毒蔓延。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) 流行病学分子遗传进化

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添加不同比例啤酒糟对育肥山羊生长性能、血清生化指标、屠宰性能和肉品质的影响

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江苏农业学报 2024年第3期40卷 500-507页

作者：王应归杨献康李鹏程訾云秀赵旺生朱江江青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室/西南民族大学四川成都610041 西南科技大学生命科学与工程学院四川绵阳621010

本研究旨在探究山羊日粮中添加不同比例啤酒糟对育肥山羊生长性能、血清生化指标、屠宰性能和肉品质的影响。随机选取24只身体状况良好、体质量相近的3月龄简州大耳羊羯羊,分为4组,分别饲喂添加0、42.90%、48.00%、53.00%啤酒糟的日粮... 详细信息

本研究旨在探究山羊日粮中添加不同比例啤酒糟对育肥山羊生长性能、血清生化指标、屠宰性能和肉品质的影响。随机选取24只身体状况良好、体质量相近的3月龄简州大耳羊羯羊,分为4组,分别饲喂添加0、42.90%、48.00%、53.00%啤酒糟的日粮。试验周期为70 d,其中预饲期14 d,正式期为56 d。结果表明,与对照相比,在日粮中添加48.00%啤酒糟处理的山羊只均经济利润显著提高,并且该处理对血清生化指标、屠宰性能和内脏指标无不利影响,还在一定水平上改善了山羊肉品质。综上所述,本研究条件下,在简州大耳羊羯羊日粮中添加啤酒糟的最适比例为48.00%。

关键词：啤酒糟简州大耳羊屠宰性能肉品质血清生化指标生长性能

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饲喂青贮黄梁木代替青贮玉米川中黑山羊肝转录组的表达分析

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 232-244页

作者：张德安杨若渚刘杰刘德武邓铭柳广斌孙宝丽郭勇庆李耀坤华南农业大学动物科学学院广州510642 华南农业大学畜禽育种国家地方联合工程研究中心广州510642 华南农业大学广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室广州510642

旨在分析饲喂青贮黄梁木替代50%青贮玉米的川中黑山羊肝转录组测序中差异表达的mRNA、lncRNA及其靶基因,挖掘饲喂青贮黄梁木影响川中黑山羊肝代谢的关键基因,从而探究青贮黄粱木的饲喂效果。试验共选取6只雄性健康川中黑山羊[5月龄,平... 详细信息

旨在分析饲喂青贮黄梁木替代50%青贮玉米的川中黑山羊肝转录组测序中差异表达的mRNA、lncRNA及其靶基因,挖掘饲喂青贮黄梁木影响川中黑山羊肝代谢的关键基因,从而探究青贮黄粱木的饲喂效果。试验共选取6只雄性健康川中黑山羊[5月龄,平均体重(21.07±4.05)kg]并随机分为两组,试验组为青贮黄梁木替代50%青贮玉米组,对照组为青贮玉米组。试验期间采用全混合日粮(TMR)进行饲喂。于试验期的最后1 d对山羊进行屠宰并取其肝,提取肝组织的RNA,构建文库后使用高通量测序技术进行转录组测序,以P川中黑山羊的肝组织中,NDUFA10、NDUFB11、NDUFS 5以及GSTA3、GSTA 4等可能从营养物质代谢和毒素代谢等方面影响肝功能。

关键词：青贮黄粱木川中黑山羊肝 lncRNA mRNA

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全株水稻青贮对奶牛生产性能的影响

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第7期52卷 9-20页

作者：宋和键彭忠利廖宇鹏曹伟王哲文胡志斌游茵洁刘垚西南民族大学畜牧兽医学院青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室动物科学国家民委重点实验室四川成都610041 四川爱客信生物科技股份有限公司四川广汉628300 四川省畜牧总站四川成都610199

【目的】通过体外产气法评价全株水稻青贮替代不同比例全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵特性的影响,筛选全株水稻青贮替代饲粮中全株玉米青贮的最佳比例,为全株水稻青贮在奶牛生产中的应用提供参考数据。【方法】采用体外产气法单因素试验,... 详细信息

【目的】通过体外产气法评价全株水稻青贮替代不同比例全株玉米青贮对奶牛瘤胃发酵特性的影响,筛选全株水稻青贮替代饲粮中全株玉米青贮的最佳比例,为全株水稻青贮在奶牛生产中的应用提供参考数据。【方法】采用体外产气法单因素试验,设Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5组,分别用全株水稻青贮替代各组饲粮中0%,25%,50%,75%和100%的全株玉米青贮(风干基础),每组5个重复,同时设2个空白(即只有瘤胃液或只有培养液而无底物)作为产气量矫正,筛选全株水稻青贮替代饲粮中全株玉米青贮的最佳比例;动物试验选用26头产奶量、胎次、泌乳时间相近的健康荷斯坦奶牛,随机分为对照组(粗饲料由全株玉米青贮组成)和试验组(采用最佳替代比例,即用全株水稻青贮替代基础饲粮中50%的全株玉米青贮)2组,每组13个重复,每个重复1头奶牛。预试期14 d,正试期106 d,探究全株水稻青贮替代基础饲粮50%全株玉米青贮对奶牛生产性能、血清生化指标、养分表观消化率及瘤胃发酵参数的影响。【结果】体外产气法单因素试验表明,试验Ⅲ组的48 h累积产气量、Ⅱ组的干物质消失率、Ⅴ组的NH_(3)-N质量浓度均高于其他各组,但相互间并无显著差异(P>0.05);试验Ⅲ组的微生物蛋白质量浓度((3.19±0.37)mg/mL)显著高于Ⅰ、Ⅱ及Ⅳ组(P0.05);所有试验组乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性酸浓度差异均不显著(P>0.05),但试验Ⅲ组的戊酸浓度((1.33±0.39)mmol/L)显著高于Ⅳ和Ⅴ组,试验组Ⅰ和Ⅱ组显著高于试验Ⅴ组(P0.05)。动物试验表明,与对照组相比,试验组奶牛生产性能指标(干物质采食量、产奶量、乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、乳尿素氮质量浓度、乳体细胞数、总固体物质量分数)、血清生化指标(总蛋白、葡萄糖、总胆固醇、甘油三脂、白蛋白、尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶)及养分表观消化率指标(粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、干物质)均无显著差异(P>0.05);奶牛瘤胃发酵参数中,除对照组的NH_(3)-N质量浓度((9.89±4.85)mg/dL)、总挥发性脂肪酸浓度((95.25±12.82)mmol/L)和丙酸体积分数(17.12%±3.44%)极显著(P0.05)。【结论】以全株水稻青贮替代奶牛饲粮中50%的全株玉米青贮是可行的。

关键词：全株水稻青贮全株玉米青贮发酵特性生产性能奶牛替代比例