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抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第2期25卷 158-160,163页

作者：吴春铃包红霞唐晓波朱大岭哈尔滨医科大学药学院生物制药学教研室黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地药物与内源性物质代谢省高校重点实验室黑龙江哈尔滨150081

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在... 详细信息

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ernblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体。Westernblot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白。免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合。结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础。

关键词： hCE-Ⅱ 原核表达融合蛋白多克隆抗体

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三氧化二砷对豚鼠心室肌细胞钾电流的影响

中国药学杂志 2008年第24期43卷 1867-1870页

作者：孙宏丽董德利李磊乔国芬刘艳初文峰杨宝峰哈尔滨医科大学大庆校区药理教研室黑龙江大庆163319 哈尔滨医科大学药理教研室黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地哈尔滨150081 哈尔滨医科大学药理教研室黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地哈尔滨150081 哈尔滨医科大学附属第五医院骨科黑龙江大庆163316

目的研究三氧化二砷(arsen ic trioxide,As2O3)对豚鼠心室肌细胞钾电流的影响,旨在探讨As2O3诱导QT间期延长的离子靶点。方法酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术深入研究As2O3对豚鼠单个心室肌细胞动作电位时程(APD)、... 详细信息

目的研究三氧化二砷(arsen ic trioxide,As2O3)对豚鼠心室肌细胞钾电流的影响,旨在探讨As2O3诱导QT间期延长的离子靶点。方法酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术深入研究As2O3对豚鼠单个心室肌细胞动作电位时程(APD)、延迟整流钾电流(IK)和内向整流钾电流(IK1)的影响。结果As2O350和100μmol.L-1分别使APD50从对照组的(273±78)m s增加到(456±35)m s(P实验电压为+70 mV时,50和100μmol.L-1As2O3分别使IK从对照组的(6.7±1.7)pA/pF减少至(4.9±1.6)pA/pF(P实验电压为-120 mV时,As2O350和100μmol.L-1分别使IK1从对照组的(-20±5)pA/pF减少至(-13±3)pA/pF(P<0.05)和(-11±2)pA/pF(P<0.05)。结论As2O3诱导QT间期延长的离子机制可能与其扰乱了心肌细胞膜离子通道间的平衡,抑制IK和IK1,从而导致APD延长有关。

关键词：三氧化二砷心室肌细胞钾电流

二氢杨梅素通过增加细胞内钙而收缩离体犬颈动脉环

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中国药理学通报 2007年第11期23卷 1437-1440页

作者：牛慧莉潘振伟朱久新曹盛吉单璐琛吕延杰杨宝峰哈尔滨医科大学药理学教研室黑龙江生物医药工程重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地黑龙江哈尔滨150086

目的观察二氢杨梅素(Dihydromyricetin)对离体犬颈动脉环的作用以及相关机制。方法应用等张收缩法记录犬离体颈动脉环张力,应用激光共聚焦显微镜测定急性分离犬颈动脉平滑肌细胞胞质内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)。结果在内皮完整和去内皮血... 详细信息

目的观察二氢杨梅素(Dihydromyricetin)对离体犬颈动脉环的作用以及相关机制。方法应用等张收缩法记录犬离体颈动脉环张力,应用激光共聚焦显微镜测定急性分离犬颈动脉平滑肌细胞胞质内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)。结果在内皮完整和去内皮血管上,二氢杨梅素均引起浓度(1~300μmol.L-1)依赖性的血管张力增加;无钙液中,二氢杨梅素引起的张力增加作用明显降低,同有钙液相比,统计学上差异有显著性(P<0.05);电压依赖性钙通道阻断剂维拉帕米不能阻断其收缩作用。激光共聚焦检测细胞内钙的结果表明,二氢杨梅素浓度依赖性(100、300μmol.L-1)增加了静息状态平滑肌细胞胞质内钙浓度。结论二氢杨梅素对血管平滑肌具有剂量依赖性的收缩作用,这一作用为非内皮依赖性,与外钙内流致胞质内钙升高有关。

关键词：二氢杨梅素血管平滑肌共聚焦细胞内钙

卡维地洛对HERG钾通道电生理功能及蛋白表达的影响

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中国药理学通报 2009年第6期25卷 737-742页

作者：史珊珊胡美钦戚志平佘柽柏刘冬敏李宝馨杨宝峰哈尔滨医科大学药学院药理学教研室黑龙江省生物医药重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地黑龙江哈尔滨150081

目的探讨卡维地洛对稳定转染HERG基因的HEK(human embryonic kidney)293细胞上的HERG钾通道的影响。方法应用全细胞膜片钳技术记录在HEK293细胞上稳定表达的HERG钾通道的电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去激活),研究不同浓度卡维... 详细信息

目的探讨卡维地洛对稳定转染HERG基因的HEK(human embryonic kidney)293细胞上的HERG钾通道的影响。方法应用全细胞膜片钳技术记录在HEK293细胞上稳定表达的HERG钾通道的电流和动力学曲线(激活、失活、复活和去激活),研究不同浓度卡维地洛对HERG电流及动力学的影响;用Western blot技术定量的观察不同浓度卡维地洛对定位于HERG-HEK细胞膜上的HERG钾通道蛋白表达的影响。结果卡维地洛(10、100nmol.L-1,1、10μmol.L-1)浓度依赖性的抑制HERG步阶电流(Istep)及其尾电流(Itail)。由Hill方程得出IC50为539.6nmol.L-1,Hillslope为-0.64。1μmol.L-1卡维地洛作用后瞬时失活、去激活时间常数明显降低(P<0.05,n=10),而激活、失活、复活动力学无明显改变;Western blot检测结果显示卡维地洛组与无加药对照组HERG蛋白的表达无差别。结论卡维地洛通过影响通道的开放状态抑制HERG钾电流,加速瞬时失活和去激活动力学,对HERG蛋白的表达及成熟无影响。

关键词：卡维地洛 HERG钾通道膜片钳技术 Western blot 技术

在大鼠中15-LO/15-HETE参与缺氧对K_V1.5表达的抑制作用

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中国药理学通报 2009年第3期25卷 326-331页

作者：褚晓杰张家宁郭蕾吴春铃张爽唐晓波朱大岭哈尔滨医科大学药学院黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验培育基地黑龙江哈尔滨150086

目的采用分子生物学技术从组织和细胞水平上观察阻断15-LO/15-HETE后,缺氧对KV1.5表达的影响。方法通过酶法分离、培养Wistar大鼠肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)和大鼠肺动脉,应用Western blot和RT... 详细信息

目的采用分子生物学技术从组织和细胞水平上观察阻断15-LO/15-HETE后,缺氧对KV1.5表达的影响。方法通过酶法分离、培养Wistar大鼠肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)和大鼠肺动脉,应用Western blot和RT-PCR方法分别从蛋白质水平和mRNA水平上观察在15-LO阻断剂CDC和NDGA作用下,缺氧对KV1.5表达的影响。结果从组织和细胞水平上,用CDC和NDGA阻断15-LO即阻断了内源性15-HETE的产生,KV1.5的表达量在蛋白质水平和mRNA水平与未阻断组比较都增加。在阻断了内源性15-HETE的产生以后,加入外源性15-HETE,KV1.5的表达量减低。说明不仅内源性15-HETE参与诱导缺氧对KV1.5表达的影响,外源性15-HETE也同样能影响缺氧条件下KV1.5的表达量。但在阻断了内源性15-HETE的产生以后,加入外源性15-HETE,KV1.5的表达量减低。说明不仅内源性15-HETE参与诱导缺氧对KV1.5表达的影响,外源性15-HETE也同样能影响缺氧条件下KV1.5的表达量。结论上述结果表明,从大鼠肺动脉组织和细胞水平上,内源性15-HETE介导了缺氧对KV1.5表达的抑制作用。

关键词： 15-HETE 缺氧肺动脉平滑肌细胞肺动脉

大明胶囊对高脂血症大鼠心肌M受体各亚型mRNA表达的影响

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中草药 2006年第9期37卷 1362-1366页

作者：邢妍岳朋李惠张勇林道红董德利吕延杰杨宝峰哈尔滨医科大学药理教研室黑龙江省生物医药工程重点实验室-省部共建国家重点实验室黑龙江哈尔滨150086

目的通过检测M受体各亚型在心肌上的mRNA表达量,研究大明胶囊对高脂血症大鼠降血脂作用的分子机制。方法制备高脂血症大鼠模型,尾静脉取血测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游离脂肪酸(FFA... 详细信息

目的通过检测M受体各亚型在心肌上的mRNA表达量,研究大明胶囊对高脂血症大鼠降血脂作用的分子机制。方法制备高脂血症大鼠模型,尾静脉取血测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游离脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等血脂指标;Trizol法提取心肌总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定M2、M3、M4、M54种M受体亚型mRNA的表达,观察其在高脂、正常和给药3种条件下的差异。结果高脂血症时血清中的TC、TG、LDL、FFA及MDA水平升高(P0.05)。结论高脂血症大鼠模型建立成功,大明胶囊具有降血脂作用,并且M3受体的水平上调是大明胶囊降血脂作用的分子机制之一。

关键词：大明胶囊 M受体高脂血症 RT—PCR

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缝隙连接蛋白43在脑心综合症中的作用研究

中国药理学通报 2008年第4期24卷 526-530页

作者：潘国聘王玲孙丽华张勇张高小杨宝峰哈尔滨医科大学药学院药理学教研室、黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地黑龙江哈尔滨150081

目的检测缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在脑心综合症模型大鼠心室肌中的表达及分布,以探讨其与脑缺血后心律失常的关系。方法用线栓法栓塞大鼠右侧大脑中动脉制备脑心综合症模型,检测心电图,电镜下观察心肌细胞的亚显微结构,采用West... 详细信息

目的检测缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在脑心综合症模型大鼠心室肌中的表达及分布,以探讨其与脑缺血后心律失常的关系。方法用线栓法栓塞大鼠右侧大脑中动脉制备脑心综合症模型,检测心电图,电镜下观察心肌细胞的亚显微结构,采用Westernblot和免疫组织化学的方法,检测心室肌中Cx43表达和分布的改变。结果电镜显示脑缺血后,心肌组织闰盘内桥粒和缝隙连接结构及分布改变,与正常对照组相比,Western blot和免疫组织化学结果均显示脑缺血后2h心室肌中Cx43的表达水平明显降低,而缺血后24h心室肌中Cx43的表达增加(P室肌Cx43蛋白表达异常并导致的QT间期延长有关。

关键词：缝隙连接蛋白43 脑心综合症心律失常 QT间期

MicroRNA在人类疾病中的作用及其作为靶点的小分子药物设计

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药学学报 2007年第11期42卷 1115-1121页

作者：张勇吕延杰杨宝峰哈尔滨医科大学药理学教研室部-省共建生物医药国家重点实验室培育基地黑龙江哈尔滨150081

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类含有约22个核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)不完全性互补配对,介导转录后基因调控。人类疾病的发生和发展过程都有miRNA参与,其表达方式与疾病的诊断、分期、进展、预后及对... 详细信息

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类含有约22个核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)不完全性互补配对,介导转录后基因调控。人类疾病的发生和发展过程都有miRNA参与,其表达方式与疾病的诊断、分期、进展、预后及对治疗的反应程度密切相关。最近的研究表明miRNA可能成为大部分疾病的治疗靶点,随之产生基于miRNA的实验技术,结果表明这些技术不仅可以通过基因特异性方式干扰miRNA的作用,还可能为今后进一步探索其功能提供良好的研究工具。另外,新技术的应用还为以miRNA为靶点设计小分子药物应用于人类疾病的基因治疗迈出重要的一步。本篇综述首先总结miRNA与肿瘤、心律失常、心力衰竭和高血压等人类疾病发病的关系,并进而探讨其为靶点进行小分子药物设计的可行性。

关键词：微小RNA 心律失常心力衰竭高血压肿瘤药物设计

三氧化二砷与白藜芦醇联用对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞存活率的影响

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中国地方病学杂志 2011年第1期30卷 9-12页

作者：于金玲何开文初文峰朴贤美乔国芬吕延杰哈尔滨医科大学药理学教研室黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地150081

目的观察三氧化二砷（ATO）与白藜芦醇（Res）联用对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞存活率的影响,并探讨其作用机制.方法采用不同剂量的ATO[0（对照）、0.1875、0.3750、0.7500、1.1250、1.5000、2.2500、3.0000、5.0000 μmol... 详细信息

目的观察三氧化二砷（ATO）与白藜芦醇（Res）联用对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞存活率的影响,并探讨其作用机制.方法采用不同剂量的ATO[0（对照）、0.1875、0.3750、0.7500、1.1250、1.5000、2.2500、3.0000、5.0000 μmol/L]、Res[0（对照）、1.5625、3.1250、6.2500、12.5000、18.7500、25.0000、37.5000、50.0000 μmol/L]孵育NB4细胞.应用四氮唑盐比色法（MTT）检测不同处理组的细胞存活率,计算ATO和Res对NB4细胞的半数抑制浓度（IC50）.根据IC50,设置联合用药比例分别为1.5∶18、.5∶25、.5∶35,并根据药物联合指数计算公式,分别计算出联合用药在不同抑制效应（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9）时的联合指数,判断ATO与Res在不同抑制效应时各自所需药物浓度之间的相互作用.应用DCFH-DA荧光探针检测对照组、ATO（1.5000 μmol/L）加药组、Res（25.0000 μmol/L）加药组、联合用药组（0.9000 μmol/L ATO＋12.5000 μmol/L Res）NB4细胞活性氧（ROS）水平,每组各检测10份样品.结果 ①ATO（≥0.7500 μmol/L）加药组NB4细胞存活率明显低于对照组（P＜0.05）,呈剂量依赖性的量效关系,IC50为（1.78±0.11）μmol/L.②Res（≥18.7500 μmol/L）加药组NB4细胞存活率明显低于对照组（P＜0.05）,呈剂量依赖性的量效关系,IC50为（18.71±0.18）μmol/L.③ATO和Res联合应用对NB4细胞存活抑制效应呈现拮抗作用.④Res加药组NB4细胞内ROS水平（1670.55±13.97）明显低于对照组（2345.88±14.48,P＜0.05）.ATO加药组NB4细胞内ROS水平（3092.42±94.84）明显高于对照组（P＜0.05）.联合用药组NB4细胞内ROS水平（1860.27±15.99）明显低于ATO加药组（P＜0.05）.结论 ATO、Res均可致NB4细胞存活率下降,而两者联合应用时表现为拮抗效应,ROS可能参与了这种拮抗作用.

关键词：三氧化二砷白藜芦醇 NB4细胞药物拮抗作用细胞存活