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表达猴痘病毒表面蛋白A35R和E8L稳转细胞株的构建与应用

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生物技术通报 2024年

作者：金浙东李惠宜包汶鑫崔彩霞袁运生上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部研究工程中心

【目的】构建稳定表达猴痘病毒（Mpox virus, MPXV）表面蛋白A35R和E8L的稳转细胞株，用于定性或定量分析相应猴痘表面蛋白的抗体或互作分子与细胞表面A35R或E8L结合活性。【方法】运用基因重组技术，构建表达A35R或E8L的慢病毒表达载... 详细信息

【目的】构建稳定表达猴痘病毒（Mpox virus, MPXV）表面蛋白A35R和E8L的稳转细胞株，用于定性或定量分析相应猴痘表面蛋白的抗体或互作分子与细胞表面A35R或E8L结合活性。【方法】运用基因重组技术，构建表达A35R或E8L的慢病毒表达载体，以HEK-293T作为宿主细胞，通过慢病毒转染技术形成稳定表达并定位在细胞表面A35R或E8L的稳转细胞株。采用Western Blot及细胞免疫荧光检测工程化细胞株中A35R或E8L的表达及蛋白定位情况，并运用流式细胞术验证稳转细胞与抗血清中多克隆抗体的结合能力。分别从表达A35R或E8L的稳转细胞中筛选出单克隆细胞株，并以单克隆稳转细胞作为工具定量分析商业化抗猴痘A35R或E8L单克隆抗体与细胞表面A35R或E8L的结合活性。【结果】成功构建稳定表达A35R或E8L并定位至细胞膜上的HEK-293T稳转细胞，经过单克隆化筛选，建立4株单克隆细胞株，其中2株稳定表达A35R(A35-2C10和A35-4E3)和2株稳定表达E8L(E8-6和E8-8)。筛选出的单克隆细胞在定量分析抗猴痘A35R或E8L的单克隆抗体结合活性方面显示出良好的拟合度。【结论】通过慢病毒转染技术构建的表达猴痘表面A35R或E8L的稳转细胞株可以作为通用研究工具，应用于抗A35与E8L中和抗体、核酸适配体或互作分子等相关分子与相应抗原结合活性的定性或定量分析。

关键词：猴痘病毒 A35R E8L 慢病毒转染稳转细胞株

低共熔溶剂双水相萃取-UPLC法检测吸烟者尿液中杂环胺类化合物

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高等学校化学学报 2024年第3期45卷 47-54页

作者：李敏贺姗姗王宏宇庄家莹金永日李绪文郑州轻工业大学食品与生物工程学院郑州450001 吉林大学化学学院长春130012

为评估香烟烟气中杂环胺的暴露水平,建立了一种基于低共熔溶剂/无机盐双水相萃取-UPLC法测定吸烟者尿液中5种杂环胺(IQ,IQ[4,5-b],Harman,Norharman和Phe-P-1)的方法.制备了7种以氯化胆碱(ChCl)为氢键受体的低共熔溶剂,并对其进行了表征... 详细信息

为评估香烟烟气中杂环胺的暴露水平,建立了一种基于低共熔溶剂/无机盐双水相萃取-UPLC法测定吸烟者尿液中5种杂环胺(IQ,IQ[4,5-b],Harman,Norharman和Phe-P-1)的方法.制备了7种以氯化胆碱(ChCl)为氢键受体的低共熔溶剂,并对其进行了表征;系统考察了影响萃取效率的主要参数,并将该方法与其它方法进行了对比研究.结果表明,在最佳提取条件下,杂环胺(HAAs)的回收率为81.9%~106.2%,日内和日间精密度分别低于2.9%和3.2%,检出限和定量限分别为0.020~0.097 ng/g和0.19~0.39 ng/g.该方法具有操作简单、环境友好及单样品成本低等特点,为尿液中杂环胺的检测提供了一种新方法,在生物样品检测领域具有良好的开发与应用价值.

关键词：杂环胺低共熔溶剂双水相萃取尿液

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基于活性和亲和性的泛素探针的发展与合成

生物化学与生物物理进展 2024年第3期51卷 598-623页

作者：许玲魏翠娜鲁显福李宜明安徽医科大学第一附属医院合肥230022 合肥工业大学食品与生物工程学院农产品生物化工教育部工程中心合肥230009

泛素(ubiquitin,Ub)作为一种重要的翻译后修饰,参与调控细胞内几乎所有的生命活动。泛素化通常由E1s、E2s、E3s以及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUBs)相互协调完成,并在底物蛋白上形成不同链长、不同连接类型的泛素链。这些泛... 详细信息

泛素(ubiquitin,Ub)作为一种重要的翻译后修饰,参与调控细胞内几乎所有的生命活动。泛素化通常由E1s、E2s、E3s以及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUBs)相互协调完成,并在底物蛋白上形成不同链长、不同连接类型的泛素链。这些泛素链可以产生多样的拓扑结构,被含有泛素结合域(Ub binding domain,UBD)的不同识别蛋白结合,进而传递不同的信号。泛素化过程或者识别蛋白的读取一旦发生错误,对细胞来说都可能是灾难性的。为深入了解泛素相关的生理机制,多种泛素探针被设计与合成,用于对目标蛋白酶或识别蛋白进行标记和监测。本综述总结了当前的泛素探针(包括基于活性和基于亲和性的探针)的最新发展,并详细阐述了它们的合成策略。进一步介绍了细胞穿梭型泛素探针在活细胞内的最新应用。

关键词：泛素活性亲和性探针化学合成

静磁场对蜜环菌发酵产物结构和理化特性的影响

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食品科学 2024年第5期45卷 184-192页

作者：高飞赵宇楠张鑫张思琳蔡丹刘景圣吉林农业大学食品科学与工程学院小麦和玉米深加工国家工程中心吉林长春130118

采用蜜环菌普通发酵及静磁场辅助发酵玉米醇溶蛋白,探究发酵期间静磁场对玉米醇溶蛋白发酵产物结构和理化特性的影响。傅里叶变换红外光谱分析发现静磁场处理改变了发酵产物蛋白的二级结构;紫外吸收光谱和内源荧光光谱分析表明,经静磁... 详细信息

采用蜜环菌普通发酵及静磁场辅助发酵玉米醇溶蛋白,探究发酵期间静磁场对玉米醇溶蛋白发酵产物结构和理化特性的影响。傅里叶变换红外光谱分析发现静磁场处理改变了发酵产物蛋白的二级结构;紫外吸收光谱和内源荧光光谱分析表明,经静磁场处理后产物蛋白分子结构舒展、基团暴露;扫描电子显微镜结果显示静磁场处理后产物蛋白表面更加粗糙,出现孔洞,比表面积增大;热力学性质分析结果显示静磁场处理后产物蛋白的变性温度明显升高,且静磁场处理使粒径减小,Zeta电位绝对值增大,游离巯基含量呈现上升趋势,二硫键含量呈现下降趋势;此外,静磁场辅助发酵明显改变了产物蛋白的理化特性,持水性、持油性、乳化性、起泡性和泡沫稳定性均明显升高,在第7天时达到最大,分别为3.86 g/g、4.22 g/g、26.83 m^(2)/g、37.67%和58.12%,乳化稳定性明显降低,在第7天时最小为34.10%。综上,静磁场辅助蜜环菌发酵玉米醇溶蛋白能够改变产物蛋白的结构,并有效改善其理化特性,进一步提高玉米醇溶蛋白的附加值和利用率。

关键词：蜜环菌玉米醇溶蛋白静磁场结构理化特性

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蜜环菌发酵玉米醇溶蛋白中蛋白酶学性质研究

中国食品学报 2024年第8期24卷 62-71页

作者：高飞李雪修琳郑明珠刘回民蔡丹刘景圣吉林农业大学食品科学与工程学院、小麦和玉米深加工国家工程中心长春130000

为探究大型食药用真菌胞外蛋白酶的相关特性,从蜜环菌发酵的玉米醇溶蛋白产物中分离、纯化蛋白酶,通过饱和硫酸铵沉淀粗酶液、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子层析柱及Sephadex G-50层析柱纯化,得到电泳纯的蛋白酶。结果表明,该蛋白酶... 详细信息

为探究大型食药用真菌胞外蛋白酶的相关特性,从蜜环菌发酵的玉米醇溶蛋白产物中分离、纯化蛋白酶,通过饱和硫酸铵沉淀粗酶液、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子层析柱及Sephadex G-50层析柱纯化,得到电泳纯的蛋白酶。结果表明,该蛋白酶的分子质量为18.4 ku;最适温度为60℃,在40~60℃具有良好稳定性;pH值为8时酶活力最高,pH值稳定性范围为6~8;Mn2+对该酶具有明显的促进作用,乙二胺四乙酸(EDTA)对中性蛋白酶有明显的抑制作用;米氏常数Km为3.786 mg/mL。研究结果为大型食药用真菌来源蛋白酶的研究与应用提供理论依据,为大型真菌源酶制剂的研发提出新思路。

关键词：蜜环菌玉米醇溶蛋白中性蛋白酶分离纯化酶学性质

连接-脱硫策略在蛋白质化学合成中的发展与应用

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高等学校化学学报 2024年第8期45卷 1-20页

作者：许玲尹盼盼鲁显福李宜明安徽医科大学第一附属医院麻醉科合肥230022 合肥工业大学食品与生物工程学院农产品生物化工教育部工程中心合肥230009

蛋白质化学合成是获取特定序列与结构蛋白质分子的关键技术,为研究蛋白质的结构与功能提供了物质基础.传统的固相多肽合成受限于分步氨基酸偶合和脱保护反应效率,难以一次性合成分子量较大的蛋白质.自然化学连接和酰肼连接技术作为无保... 详细信息

蛋白质化学合成是获取特定序列与结构蛋白质分子的关键技术,为研究蛋白质的结构与功能提供了物质基础.传统的固相多肽合成受限于分步氨基酸偶合和脱保护反应效率,难以一次性合成分子量较大的蛋白质.自然化学连接和酰肼连接技术作为无保护肽片段间连接的策略,具有高效选择性,极大地推动了蛋白质化学合成的发展.然而,这些连接策略需依托蛋白质中丰度较低的半胱氨酸,难以适用于无半胱氨酸或者半胱氨酸不合适作为连接位点的蛋白质的合成.连接-脱硫策略的提出首次将连接位点拓展至丙氨酸,并促进了硫代氨基酸的发展,使得蛋白化学合成不再受限于连接位点的选择.在此基础上,自由基脱硫、光化学脱硫、P-B脱硫和铁催化脱硫等新兴脱硫技术的进步为蛋白质化学合成提供了多样化的选择,拓展了其应用范围.连接-脱硫的化学方法不断地演进创新,丰富了蛋白质化学合成方法库,为蛋白质工程与化学生物学领域的深入研究提供了重要支持.本综合评述以时间线的形式,全面回顾了连接-脱硫化学方法在蛋白质化学合成中的发展历程.从早期基于半胱氨酸位点的自然化学连接和酰肼连接技术,到连接-脱硫策略的开创性发展,再到硫代氨基酸和多样化脱硫策略的探索,这些技术不仅丰富了多肽合成的策略,也展示了它们在合成蛋白质中的广阔应用前景和发展潜力.本文旨在为蛋白质化学合成领域的科研工作者提供深刻的见解和有价值的信息,激发该领域的进一步探索与创新.

关键词：自然化学连接蛋白酰肼连接脱硫蛋白质化学合成硫代氨基酸

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冰晶生长对冷冻水产品品质影响及新型冷冻方式研究进展

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现代食品科技 2024年第2期40卷 366-373页

作者：罗江美赵茜赵健茹孙海涛邵信儒王超曹亚茹汪灵松韦凤举通化师范学院食品科学与工程学院吉林通化134000 通化师范学院长白山食用植物资源开发工程中心吉林通化134000 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江杭州310018 吉林医药学院公共卫生学院吉林吉林132013

冷冻技术在水产品保鲜方面应用广泛,但水产品在冻结过程中受冰晶形成、晶体生长与冰晶重结晶的影响,易造成细胞结构的破损,导致水产品品质下降。为深入分析冰晶生长与水产品品质变化间的关系,该文总结了冰晶生长对水产品的蛋白质变性、... 详细信息

冷冻技术在水产品保鲜方面应用广泛,但水产品在冻结过程中受冰晶形成、晶体生长与冰晶重结晶的影响,易造成细胞结构的破损,导致水产品品质下降。为深入分析冰晶生长与水产品品质变化间的关系,该文总结了冰晶生长对水产品的蛋白质变性、脂肪氧化、持水力、质构及感官特性影响,综述了物理场辅助冻结及添加抗冻剂、重结晶抑制剂等减小冰晶尺寸的新方法,为控制冰晶生长及提高冷冻水产品品质提供了理论参考。

关键词：冰晶生长水产品冷冻品质新型冷冻方式

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基于Wenner和Schlumberger双组态融合的土壤电导率测量装置

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农业工程学报 2024年第1期40卷 90-99页

作者：齐江涛王凯晨包志远张伟荣郭慧刘向南李宁吉林大学工程仿生教育部重点实验室长春130022 吉林大学生物与农业工程学院长春130022

土壤电导率的准确、实时和原位获取可为农业生产精准管理提供有效的数据支撑,为提高传统电流-电压四端法测量精度,该研究基于电流-电压四端法3种测量组态,开展土壤电导率主要影响因素(土壤含水率、电极入土深度、土壤坚实度和土壤处理方... 详细信息

土壤电导率的准确、实时和原位获取可为农业生产精准管理提供有效的数据支撑,为提高传统电流-电压四端法测量精度,该研究基于电流-电压四端法3种测量组态,开展土壤电导率主要影响因素(土壤含水率、电极入土深度、土壤坚实度和土壤处理方式)对电流-电压四端法的3种测量组态测量精度影响的试验。结果表明,Wenner和Schlumberger两种测量组态可较好地适用于不同土壤环境条件。进一步以Wenner和Schlumberger两种测量组态所测土壤电导率值为输入量,基于BP神经网络构建了双组态融合的土壤电导率回归模型,并在此基础上设计了一种土壤电导率测量装置,该装置主要包括JESTON nano、STM32单片机数据采集模块、传感器、激励源及差分放大模块等组件。工作稳定性试验结果显示,该装置在不同土壤电导率梯度条件下测量数据的标准偏差均小于0.43μS/mm;田间性能对比试验结果显示,该装置测量数据的均方根误差值为0.18μS/mm,测量精度优于传统单独测量组态和市面常用土壤电导率测量仪,以上结果表明所研制的土壤电导率测量装置具有较好的工作稳定性和测量精度。该研究可为田间土壤信息的实时原位采集提供一种高精度的检测工具和技术手段。

关键词：土壤电导率测量组态 BP神经网络模型测量装置

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米汤炮制天麻工艺的优化及抗炎作用

食品工业科技 2024年第16期45卷 358-367页

作者：董欣隋欣彤胡力铭王仁广李占国王景龙王淑敏梁磊长春中医药大学药学院吉林长春130117 吉林省中科生物工程股份有限公司吉林长春131508 吉林省蒲川生物医药有限公司吉林长春131508

优选米汤制天麻的炮制工艺,并考察其对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞(BV-2)炎症反应的作用。采用高效液相色谱法检测天麻提取物中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A的含量,以六种成... 详细信息

优选米汤制天麻的炮制工艺,并考察其对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞(BV-2)炎症反应的作用。采用高效液相色谱法检测天麻提取物中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A的含量,以六种成分含量为评价指标,以米汤与水体积比、煮制时间、干燥温度为单因素变量,在单因素的基础上,通过三个指标综合考虑,设计正交试验,优化米汤制天麻的制备工艺,并比较6种成分在不同炮制品中的含量。脂多糖诱导的神经炎症细胞模型,CCK-8法测定天麻炮制品提取物对BV2细胞存活率的影响;ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的释放水平;Western blot法检测TLR4、MYD88、P65、INOS、COX-2、IL-1β蛋白的表达变化。结果表明,煮制时间和米汤与水体积比对试验结果有显著(P<0.05)影响,米汤制天麻的炮制工艺:米汤与水体积比为1:3,煮制25 min,75℃烘干。米汤制品中6种成分含量综合评分高于蒸制制品。天麻提取物对LPS诱导BV2细胞损伤具有不同程度的保护作用。与正常对照组比较,LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌显著上升(P<0.001),与LPS组,两种炮制品均可抑制TNF-α(P<0.05)、IL-1β(P<0.05,P<0.001)、IL-6(P<0.05,P<0.001)的释放。Western blot结果显示,与LPS组比较,两种炮制品可能显著抑制LPS诱导的TLR4/MYD88/NF-κB信号通路的激活,减少TLR4(P<0.01)、MYD88(P<0.01,P<0.05)、P65(P<0.01)、INOS(P<0.05)、COX-2(P<0.05,P<0.001)、IL-1β(P<0.001)蛋白的表达。优选的米汤制天麻工艺操作简便,稳定可行;天麻炮制品可能通过抑制TLR4/MYD88/NF-κB信号通路,而降低炎症因子的表达。

关键词：天麻米汤制正交试验法神经炎症

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