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Sirt1在氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤中的保护作用

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中国兽医学报 2024年第5期44卷 1000-1007页

作者：张宇飞周博文程薪同付守鹏柳巨雄郭文晋吉林大学动物医学学院吉林长春130062 嘉立荷唐山牧业有限公司河北唐山063000 天津农垦康嘉生态养殖有限公司天津300000

旨在初步阐明Sirt1在奶牛乳腺氧化应激中对紧密连接的影响及机制。以奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为研究对象,使用H2O2诱导细胞氧化应激构建细胞模型,添加Sirt1激动剂SRT 2104,使用流式细胞术检测细胞中活性氧的含量;通过RT-PCR检测Sirt1基... 详细信息

旨在初步阐明Sirt1在奶牛乳腺氧化应激中对紧密连接的影响及机制。以奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为研究对象,使用H2O2诱导细胞氧化应激构建细胞模型,添加Sirt1激动剂SRT 2104,使用流式细胞术检测细胞中活性氧的含量;通过RT-PCR检测Sirt1基因的转录水平;用Western blot检测Sirt1、ZO-1、Occludin、Cludin 3、p38MAPK、JNK、MLCK、MLC2的蛋白表达水平;通过细胞免疫荧光检测ZO-1、Occludin、Cludin 3的表达;同时使用试剂盒检测细胞的抗氧化能力。结果表明,H2O2刺激会显著抑制MAC-T细胞活性并抑制Sirt1基因的表达以及Sirt1、ZO-1、Occludin和Cludin 3的蛋白表达;SRT 2104可以有效改善H2O2刺激导致的ZO-1、Occludin和Cludin 3的蛋白表达下降;同时SRT 2104会增强细胞的抗氧化能力并抑制p38MAPK、JNK、MLCK蛋白的表达和MLC2的磷酸化。以上结果表明Sirt1通过抑制p38MAPK/JNK信号传导途径增强细胞的抗氧化能力和紧密连接蛋白表达。

关键词： Sirt1 奶牛乳腺上皮细胞紧密连接 p38MAPK JNK

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鼻疽诊断与防治技术研究进展

中国兽医学报 2024年第3期44卷 644-650页

作者：胡晓祥熊秋婷刘倩刘明远方仁东西南大学动物医学院重庆北碚400715 吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室/人兽共患病研究教育部重点实验室吉林长春130062

鼻疽(glanders)是一种由鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei,***)引起,主要存在于单蹄兽中的高度传染性人兽共患病,在人类中发生病例较少。自然感染的人类病例呈现地方流行性,主要发生在接触过受感染单蹄兽的人群中。此外,实验室工... 详细信息

鼻疽(glanders)是一种由鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei,***)引起,主要存在于单蹄兽中的高度传染性人兽共患病,在人类中发生病例较少。自然感染的人类病例呈现地方流行性,主要发生在接触过受感染单蹄兽的人群中。此外,实验室工作人员中也有病例报告。世界动物卫生组织(WOAH)一直在努力进行全球性的鼻疽根除工作,通过全面监测、扑杀受感染动物和采取严格进口措施,该病在北美、澳大利亚和欧洲大部分地区已被根除。然而,随着牲畜的全球性流动,导致世界其他地区的病例增加,非洲、亚洲、中东和南美洲仍然存在区域性流行。近些年来在中东和亚洲暴发的鼻疽疫情为鼻疽重新传入无疫病地区创造了可能。因此,鼻疽被归类为一种重新出现的疾病,再次威胁人类和动物健康。

关键词：鼻疽诊断检测疫苗综合防治

BCSP31蛋白双抗夹心ELISA定量方法的建立及应用

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 699-705页

作者：陈凯楠李金斗丁佳欣冯嘉轩于喜冰单春晖汪思捷丁壮吉林大学动物医学学院人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室吉林长春130062 长春中医药大学临床医学院吉林长春130117

通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和... 详细信息

通过原核表达系统制备、纯化布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗核心组分BCSP31蛋白,并将其作为免疫原及标准品分别免疫新西兰大白兔(1mg/只)和BALB/c鼠(200μg/只)制备兔源捕获多克隆抗体和鼠源检测多克隆抗体,对双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数、封闭液种类及封闭条件、酶标二抗工作条件等参数进行优化,结果显示兔多克隆抗体最佳包被浓度和鼠多克隆抗体最佳稀释倍数均为1∶1600、3%脱脂奶粉封闭1h、酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000、酶标二抗孵育时间1h、显色时间为15min的条件下建立的双抗夹心ELISA方法效果最好。按照上述最佳反应条件对布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗(BCSP31-cVLPs)核心抗原成分BCSP31蛋白进行定量检测,并对其敏感性、特异性、重复性等性能进行评价,结果显示1μL布鲁菌嵌合病毒样颗粒中的BCSP31含量约占总蛋白含量的14.187%;将布鲁菌嵌合病毒样颗粒稀释640倍后,P/N值仍大于2.1,有较高的敏感性;与FAdV、IBDV、NDV、AIV等其他病毒样颗粒均无交叉反应,特异性高;批间和批内变异系数均在10%以下,重复性良好。该方法的建立为推进布鲁菌嵌合病毒样颗粒疫苗的质量控制标准建立及商品化奠定了基础。

关键词：布鲁菌病嵌合病毒样颗粒 BCSP31蛋白双抗夹心ELISA方法参数优化应用

2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2024年第5期46卷 511-521页

作者：张艺潇吴梦米士江刘钟迪涂长春龚文杰吉林大学动物医学学院吉林长春130062 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130012 重庆市畜牧科学院重庆408599

为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检... 详细信息

为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测r E2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定r E2的反应原性。SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好。采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类。将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性。采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性。结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株。其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应。表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb。MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70μg/μL且该MAb TCH061重链为Ig G2a,轻链为κ链。中和活性结果显示,TCH061对JL^(23)株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株。分别以GD53株E^(24)个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域。利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点。利用杆状病毒表达CSFV JL^(23)株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性。Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1~aa90,且其识别CSFV E2蛋白P^(20)不识别L^(20)的CSFV。通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G^(19)、P^(20)、L^(21)、G^(22)、A^(23)和E^(24)在空间上比较接近;MAb TCH061与JL^(23)株I18M突变的E2蛋白反应,与G^(19)K、P^(20)L和L^(21)P突变的E2蛋白均不反应,与G^(22)K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L^(20)P突变的E2蛋白反应。证实TCH061的抗原表位为^(19)GPLG^(22),经Py MOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa^(20),其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P^(20)是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸。综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源。

关键词：猪瘟病毒单克隆抗体病毒反应性抗原表位

基于双质粒拯救系统的新城疫病毒LaSota株的拯救

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微生物学报 2024年第5期64卷 1567-1579页

作者：宗宪春段姝宇朱广美徐哲肖萌萌王丹贺怀悦王建忠吉林农业大学动物医学院动物重大疫病微生态疫苗(药物)教育部工程研究中心吉林长春130118

传统新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)的拯救系统包括一个cDNA克隆质粒和分别表达NDV的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒,且必须满足4个质粒同时转染进入同一个宿主细胞才能完成病毒的组装,效率相对低下... 详细信息

传统新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)的拯救系统包括一个cDNA克隆质粒和分别表达NDV的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒,且必须满足4个质粒同时转染进入同一个宿主细胞才能完成病毒的组装,效率相对低下。【目的】提高NDV的拯救效率,并建立双质粒高效拯救系统。【方法】将NP、P、L基因表达盒串联克隆至真核表达载体pCI中,构建为可同时表达NP、P、L蛋白的单辅助质粒PCI-NPL;同时,采用分段克隆再拼接的方式,将NDVLaSota株基因组cDNA克隆于真核表达质粒pCI的CMV启动子下游,并分别在P和M基因中插入报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、5′端引入锤头状核酶序列、3′端引入丁型肝炎病毒核酶序列,构成全基因组转录质粒pCI-LaSota-EGFP;以pCI-LaSota-EGFP和pCI-NPL组成病毒拯救系统共转染至BHK-21细胞,拯救获得重组子代病毒rLaSota-EGFP,并进行系列生物学特性鉴定。【结果】经RT-PCR、荧光显微镜观察、Western blotting、生长特性测定等系列鉴定,证明rLaSota-EGFP构建正确,成功拯救获得了重组病毒rLaSota-EGFP,且与野生型(wild-type,WT)LaSota具有相似的生物学特性。【结论】基于CMV启动子的NDV双质粒新型拯救系统构建成功,为重组NDV及其他副黏病毒的高效拯救奠定了基础。

关键词：反向遗传学技术新城疫病毒病毒拯救双质粒拯救系统

盐酸白屈菜红碱逆转肺炎克雷伯菌中tmexCD1-toprJ1介导的高水平替加环素抗性

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 748-756页

作者：杨金典徐蕾吕冠辰崔民河朱先鹏邓旭明吉林大学动物医学学院吉林长春130062 吉林省牧硕养殖有限公司吉林长春130500 吉林省柳河县农业综合行政执法大队吉林通化135300

通过棋盘试验、生长曲线试验、杀菌曲线试验、细菌膜通透性检测试验、外排泵功能检测试验、细胞毒性试验以及大蜡螟存活率试验等筛选出TMexCD1-TOprJ1外排泵抑制剂并验证其体内外替加环素协同抗菌活性。结果显示,白屈菜(Herba chelidon... 详细信息

通过棋盘试验、生长曲线试验、杀菌曲线试验、细菌膜通透性检测试验、外排泵功能检测试验、细胞毒性试验以及大蜡螟存活率试验等筛选出TMexCD1-TOprJ1外排泵抑制剂并验证其体内外替加环素协同抗菌活性。结果显示,白屈菜(Herba chelidonii)中活性成分盐酸白屈菜红碱显著提高替加环素的抗肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,***)活性(FICI≤0.5),通过与TMexC1/TMexD1/TOprJ1活性位点结合,抑制细菌外排泵的功能,同时增强替加环素对细菌膜的损伤,从而发挥与替加环素协同杀菌的作用;盐酸白屈菜红碱对J774A.1、Hep-2细胞无毒性作用。结果表明,盐酸白屈菜红碱作为一种新型替加环素增效剂具有抗击高致病性***感染的潜力,为***感染治疗提供了候选先导化合物。

关键词：盐酸白屈菜红碱替加环素 TMexCD1-TOprJ1 协同活性肺炎克雷伯菌

β-谷甾醇对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化的影响

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中国兽医学报 2024年第5期44卷 994-999页

作者：徐平阚兴池黄雅萍付守鹏柳巨雄吉林大学动物医学学院吉林长春130062 上海市动物疫病预防控制中心上海201103 之江实验室智能计算平台研究中心浙江杭州311121

乳腺纤维化对奶牛养殖业造成巨大的经济损失,本研究的目的是探究β-谷甾醇(BSS)对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化是否具有缓解作用。试验分为空白对照组、模型组、模型+药物处理组,以乳腺灌注TGF-β1的方式构建小鼠乳腺纤维化模型,待模型... 详细信息

乳腺纤维化对奶牛养殖业造成巨大的经济损失,本研究的目的是探究β-谷甾醇(BSS)对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化是否具有缓解作用。试验分为空白对照组、模型组、模型+药物处理组,以乳腺灌注TGF-β1的方式构建小鼠乳腺纤维化模型,待模型构建完24 h收集小鼠乳腺组织。应用HE染色和Masson染色评价乳腺组织病理结构的变化情况;应用荧光定量PCR方法检测乳腺组织中collagenⅠ、α-SMA、vimentin (VIM)等纤维化相关蛋白的mRNA水平变化;应用Western blot和免疫荧光技术检测collagenⅡ、E-cadherin (E-cad)和α-SMA用于评价乳腺组织中纤维化蛋白表达情况。结果显示,BSS预处理后可以显著缓解TGF-β1诱导的小鼠乳腺病理损伤,显著抑制collagenⅠ、α-SMA、VIM mRNA水平的升高,显著抑制collagenⅡ、α-SMA蛋白水平的升高和E-cad蛋白水平的降低。BSS通过抑制纤维化表型指标的升高有效缓解纤维化病变的发生发展。

关键词： β-谷甾醇乳腺纤维化细胞外基质转化生长因子β1

肺炎克雷伯菌K7R噬菌体生物学特性及其抗性菌株的抗性机制

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中国兽医学报 2024年第3期44卷 504-513页

作者：付瑶张昊袭恒豫冀亚路徐莉顾敬敏韩文瑜吉林大学动物医学学院吉林长春130062 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225000 长春市动物疫病预防控制中心吉林长春130061

以肺炎克雷伯菌K7R为宿主菌分离得到1株长尾噬菌体vB_KpnS_ZH01(简称P-K7R),其最佳感染复数为0.01,潜伏期约为10 min,暴发量为169 PFU/cell,且具有稳定、良好的杀菌活性。全基因组测序结果显示,P-K7R全长为52111 bp,共编码86个开放阅读... 详细信息

以肺炎克雷伯菌K7R为宿主菌分离得到1株长尾噬菌体vB_KpnS_ZH01(简称P-K7R),其最佳感染复数为0.01,潜伏期约为10 min,暴发量为169 PFU/cell,且具有稳定、良好的杀菌活性。全基因组测序结果显示,P-K7R全长为52111 bp,共编码86个开放阅读框。经过诱导,获得P-K7R抗性菌K7R-5P,尽管K7R-5P和K7R在显微镜下菌株、菌落形态以及生长曲线无明显差异,但在两者转录组学水平上检测到ompC、ompF、N5、N102及N103五个差异基因。此外,K7R-5P与K7R对噬菌体在吸附率上有明显差异,K7R的吸附效率达到80%以上,而K7R-5P的吸附效率不足20%。最后,利用qRT-PCR对转录组学结果进行验证,结果显示K7R-5P的ompC基因表达量恢复之后,菌株对噬菌体P-K7R的抗性消失,表明ompC基因在噬菌体P-K7R吸附肺炎克雷伯菌过程中起着关键作用。结果表明,成功获得1株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体P-K7R并在体外探究了细菌对噬菌体K7R-5P产生抗性的机制,为噬菌体治疗的进一步高效应用奠定了基础。

关键词：肺炎克雷伯菌噬菌体噬菌体抗性转录组学吸附受体

ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs疫苗在SPF鸡中的攻毒保护效果评价

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中国兽医学报 2024年

作者：郭春红冯嘉轩李金斗丁佳欣丁壮吉林大学动物医学学院人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室吉林元和元生物工程有限公司长春中医药大学临床医学院

采用血凝抑制试验、ELISA方法、淋巴细胞增殖试验、细胞因子检测和攻毒保护试验等方法评价“新腺”二联三价嵌合型病毒样颗粒疫苗（ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs）在SPF鸡体内诱导的体液免疫和细胞免疫能力及提供针对强毒株攻击的保护效率。... 详细信息

采用血凝抑制试验、ELISA方法、淋巴细胞增殖试验、细胞因子检测和攻毒保护试验等方法评价“新腺”二联三价嵌合型病毒样颗粒疫苗（ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs）在SPF鸡体内诱导的体液免疫和细胞免疫能力及提供针对强毒株攻击的保护效率。结果显示,ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs可刺激机体产生高效的针对NDV的血凝抑制抗体、针对FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b的ELISA抗体;针对NDV、FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b灭活病毒的刺激,NDFAdV-4/8a/8b cVLPs免疫组鸡脾脏淋巴细胞可发生活化和增殖。此外,ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs诱导产生Th1型细胞因子（IFN-γ和IL-2）和Th2型细胞因子（IL-4和IL-5）的含量均高于商品疫苗禽腺病毒（Ⅰ群4型）三联灭活疫苗（La Sota株+YT株+QD株）。攻毒试验结果显示,NDV NA-1株通过滴鼻、点眼方式给予0.1 mL (含10～5 ELD50/0.1 mL),FAdV-4、8a、8b通过肌肉注射方式给予0.1 mL(含10～5 TCID50/0.1 mL),ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs免疫后可提供针对NDV、FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b强毒株攻击的有效保护,且缩短了口咽和泄殖腔拭子排毒时间。该研究为ND-FAdV-4/8a/8b cVLPs疫苗的转化及应用奠定了基础,同时也为新城疫和禽腺病毒病多联多价新型疫苗的开发提供新思路。

关键词：新城疫禽腺病毒病嵌合型病毒样颗粒疫苗免疫保护效果