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重组抗淀粉样β肽单克隆抗体药物的质量控制研究

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中国新药杂志 2024年第12期33卷 1224-1232页

作者：武刚于传飞李萌崔永霏郭璐韵梅玉婷杨雅岚徐刚领王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室/药品监管科学全国重点实验室/国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室/国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629

目的:研究并建立针对抗淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)单克隆抗体的关键质量属性质量控制方法。方法:基于胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行肽指纹图谱分析,分子排阻色谱法(SE-HPLC)进行单体聚体纯度分析,采用还原/非还原十二... 详细信息

目的:研究并建立针对抗淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)单克隆抗体的关键质量属性质量控制方法。方法:基于胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行肽指纹图谱分析,分子排阻色谱法(SE-HPLC)进行单体聚体纯度分析,采用还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)进行大小变异体纯度分析,采用阳离子色谱法(CEX-HPLC)进行电荷变异体纯度分析,采用HILIC-UPLC法进行寡糖分析,采用ELISA法测定Aβ抗原相对结合活性。其他各项指标均应符合《中华人民共和国药典》2020年版以及其他相关要求。结果:肽指纹图谱起到良好的鉴别作用;SE-HPLC法中单体相对百分含量为(99.40±0.00)%,聚体的相对百分含量为(0.55±0.00)%;还原CE-SDS法中轻重链之和的相对百分含量为(98.11±0.08)%,非还原CE-SDS法的主峰相对百分含量为(96.57±0.15)%,HHL峰相对百分含量为(1.91±0.10)%;CEX-HPLC法中主成分相对百分含量为(75.08±0.06)%,酸性变异体的相对百分含量为(16.12±0.05)%,碱性变异体的相对百分含量为(8.80±0.05)%;HILIC-UPLC寡糖图谱分析的(G0F+G1F+G2F),Man5,G0相对百分含量分别为(91.56±0.04)%,(1.21±0.03)%,(2.60±0.01)%;ELISA法中与Aβ抗原的相对结合活性为(101.40±0.53)%。结论:针对抗Aβ单抗的质量属性,研究建立质控方法并进行质量研究,确保产品安全有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据。

关键词：淀粉样肽单克隆抗体鉴别纯度分析生物学活性

利用高分辨质谱技术综合解析胰岛素类制品复杂二硫键结构

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药学学报 2024年第1期59卷 188-197页

作者：胡馨月丁晓丽孙悦张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其... 详细信息

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其类似物中存在两对没有酶切位点的二硫键,常规的碰撞诱导解离(CID)和高能诱导裂解(HCD)无法实现该复杂二硫键的准确定位。本研究通过3种方法综合定位该复杂二硫键,包括酶切加关键肽段源内碎裂(ISD)法、酶切加部分还原烷基化法、完整蛋白源内碎裂和电子转移解离(ETD)裂解法,并且考察了门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素的适用性,为胰岛素及其类似物二硫键连接方式的质量控制提供了新途径,也为含该类复杂二硫键多肽或蛋白类生物制品的二硫键定位提供借鉴。

关键词：胰岛素及其类似物二硫键定位部分还原烷基化源内碎裂电子转移裂解

qPCR在重组腺相关病毒产品大片段宿主细胞残留DNA检测中的应用

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中国生物制品学杂志 2024年第7期 775-778+787页

作者：王光裕史新昌杨靖清李响于雷周勇中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的考察qPCR法检测重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）基因治疗产品中大片段宿主细胞残留DNA(host cell residual DNA,HCD)的可行性。方法提取4种不同血清型rAAV核酸，采用qPCR法对宿主HEK293细胞基因组长... 详细信息

目的考察qPCR法检测重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）基因治疗产品中大片段宿主细胞残留DNA(host cell residual DNA,HCD)的可行性。方法提取4种不同血清型rAAV核酸，采用qPCR法对宿主HEK293细胞基因组长末端重复序列（long terminal repeat sequence,LTR）中244和562 bp两个片段序列进行特异性定量，计算HCD在基因组中的占比。结果可在qPCR法定量限范围内检出4种不同血清型rAAV样品大片段HCD，占比为0.3%～5.4%，且随着检测片段长度增加，占比呈降低趋势。结论 qPCR技术可用于rAAV产品中大片段HCD的检测。

关键词：荧光定量PCR 重组重组腺相关病毒基因治疗产品宿主细胞残留DNA

猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

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中国农业科学 2024年第1期57卷 216-226页

作者：王海燕张珍珍倪博刘蓓蓓冯志新江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层，破坏呼吸道炎性反应平衡，引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸... 详细信息

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层，破坏呼吸道炎性反应平衡，引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白，被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手，分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用，揭示Mhp引起炎性损伤的新机制，为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞（porcine bronchial epithelial cells,PBECs）感染模型和猪体感染模型，通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法，分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定，构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时，设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭，通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中，通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因，后感染Mhp，利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法，明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变，主要组织病理表现为肺脏炎性损伤，同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后，体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明，Mhp可诱导肺脏炎性反应，抑制SPLUNC1表达。另一方面，体外PBECs中过表达SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少；siRNA干扰SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加，表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程，本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明：无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育，还是SPLUNC1抗体体内封闭，Mhp的体内外生长均未受影响；SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响；过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活，相反SPLUNC1 siRNA干扰后，可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附，而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达，维护宿主炎性平衡；与此同时，Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控，进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。

关键词：猪肺炎支原体支原体-宿主相互作用炎性反应 SPLUNC1

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报告基因法测定人绒毛膜促性腺激素生物活性

药学学报 2024年第2期59卷 432-438页

作者：黄盈张孝明李鹤洋王绿音张慧吕萍李晶高向东梁成罡中国药科大学江苏南京211198 中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

本研究根据人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)与受体结合后激活cAMP信号通路,构建一种LHCGR-CRE-luc-HEK293转基因细胞系,采用荧光素酶检测系统对hCG进行生物活性检测,利用四参数拟合分析计算样品相对效价。并且对... 详细信息

本研究根据人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)与受体结合后激活cAMP信号通路,构建一种LHCGR-CRE-luc-HEK293转基因细胞系,采用荧光素酶检测系统对hCG进行生物活性检测,利用四参数拟合分析计算样品相对效价。并且对该方法条件进行优化,对方法的专属性、相对准确度、精密度和线性进行验证。结果显示,hCG浓度与报告基因表达量存在量效关系,且符合四参数曲线。经优化后,条件确定为hCG初始浓度为2.5μg·mL-1,稀释倍数为1∶4,细胞数为每孔10000~15000个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,相对准确度的相对偏倚范围在-8.9%~3.4%,线性回归方程相关系数为0.996,中间精密度几何变异系数范围为3.3%~15.0%,线性范围为50%~200%。本研究成功建立并验证了一种报告基因法检测hCG生物学活性,可以用于hCG生物活性检测和质量控制。

关键词：报告基因法人绒毛膜促性腺激素四参数曲线生物活性方法学验证

反相液相色谱-质谱联用技术对重组腺相关病毒6型衣壳蛋白的表征分析

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中国生物制品学杂志 2024年第7期 769-774页

作者：郭莹李响张拓史新昌何娟聂爱英裴德宁周勇秦玺梁成罡中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室沃特世科技(上海)有限公司

目的应用反相液相色谱-质谱（reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry,RPLC-MS）联用技术对重组腺相关病毒6型（recombinant adeno-associated virus 6,rAAV6）载体的衣壳蛋白进行表征分析，包括一级结构和翻译后修饰（post-translational modification,PTM）。方法流动相A为0.1%二氟乙酸（difluoroacetic acid,DFA）的水溶液；流动相B为0.1%DFA的乙腈溶液；柱温：80℃；梯度洗脱10 min(0→10 min，流动相B 15%→45%)。ESI-Q-TOF质谱检测设为阳离子模式：质荷比扫描范围400～4 000 m/z；扫描频率：2 Hz，锥孔电压：80 V；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：120℃。结果 AAV衣壳蛋白VP1实测相对分子质量为81 255.9，与理论值偏差为8.1 ppm;VP2蛋白实测相对分子质量为66 062.9，与理论值偏差为3.8 ppm;VP3蛋白实测相对分子质量为59 488.6，与理论值偏差为36 ppm。rAAV6酶切后质量肽图分析，样品序列覆盖率为89%，检测到的PTM主要包括脱酰胺、N-末端乙酰化、泛素化、磷酸化等，并未发现糖基化修饰位点。通过串联质谱分析确证了rAAV6衣壳蛋白N-末端和C-末端的序列以及N-末端的PTM。结论应用RPLC-MS联用技术分析了rAAV6衣壳蛋白的完整相对分子质量，并在肽段水平运用串联质谱深度分析了rAAV6衣壳蛋白的PTM，对AAV基因治疗制品的质量控制及生产工艺的提高具有一定意义。

关键词：腺相关病毒衣壳蛋白反相液相色谱串联质谱相对分子质量肽图

SARS-CoV-2 mRNA疫苗通用体外生物学活性检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2024年第3期37卷 322-328页

作者：王新竹赵丹华苏歧刘欣玉姜崴叶强中国食品药品检定研究院北京102629 长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130012

目的建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证,以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量,建... 详细信息

目的建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证,以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量,建立SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法,并进行验证。结果筛选到1种对各变异株S蛋白均能良好结合的试剂盒,并确定了转染细胞为HEK293T、细胞铺板浓度为2.5×10^(5)个/mL、转染剂量为6孔板4μg/孔,建立了通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法。验证结果显示,该方法能满足检定需求。结论建立的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法相对准确度、线性、中间精密度、范围良好,可用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。

关键词： SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性酶联免疫吸附测定

2017-2021年北京市20岁以下带状疱疹病原特点和临床特征分析

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中华预防医学杂志 2024年第3期58卷 285-291页

作者：潘静彬周涛索罗丹袁力勇权娅茹王海红彭兴慧王涛朱宗龙王砚飞赵丹卢莉北京市疾病预防控制中心免疫预防所北京100013 中国食品药品检定研究院生物制品检定所北京102629 北京市昌平区疾病预防控制中心计划免疫科北京102200 北京市密云区疾病预防控制中心计划免疫科北京101500

目的:分析2017-2021年北京市20岁以下带状疱疹病毒(VZV)感染病例病原特点和临床特征。方法:带状疱疹病例来源于2017年12月至2021年4月北京市带状疱疹监测系统,包括两个哨点区(密云区和昌平区)7家哨点医院的20岁及以下带状疱疹病例。首... 详细信息

目的:分析2017-2021年北京市20岁以下带状疱疹病毒(VZV)感染病例病原特点和临床特征。方法:带状疱疹病例来源于2017年12月至2021年4月北京市带状疱疹监测系统,包括两个哨点区(密云区和昌平区)7家哨点医院的20岁及以下带状疱疹病例。首次就诊时收集病例基本信息,并采集病原学标本,调查其出疹日期、疱疹部位、疱疹数量等;出疹21 d时通过电话随访调查疼痛程度、疱疹持续时间、疼痛持续时间等临床特征;出疹90 d时对出疹21 d随访仍有神经痛者再次调查其疼痛情况判断是否发生带状疱疹后神经痛。提取疱疹液中的病毒DNA后对其ORF62基因区域进行PCR扩增和一代测序获取病毒序列,通过序列比对鉴定野毒株/疫苗株,并比较不同水痘疫苗接种史病例的临床特征。结果:2017-2021年北京市20岁及以下带状疱疹病例共计78例,其中61例病例完成随访调查。61例病例的年龄范围为1.83~20.54岁,年龄 M为17.50岁;男性36例(59.02%),女性25例(40.98%);有水痘接种史者29例(1、2剂次接种史者分别为18、5例,剂次不详者6例),无水痘疫苗接种史的13例,接种史不详者19例。78例病例中VZV核酸阳性者64例,其中62例鉴定结果为野毒株,2例为疫苗株;2例疫苗株病例均为2岁女童,均有1剂水痘疫苗接种史,分别于接种疫苗后3个月和13个月后发病。29例有水痘疫苗接种史的带状疱疹病例的疱疹数量以10~49个为主,占58.62%(17例);疱疹部位以躯干为主,占44.83%(13例);疼痛程度“无或轻度”占比51.72%(15例);带状疱疹病例最痛评分、疼痛持续时间、疱疹完全结痂时间的 M( Q1, Q3)分别为3(1.5,5)分、10(1.5,12.5)d、10(6.5,13)d,均未发生带状疱疹后神经痛。有接种史、无接种史和接种史不详者疱疹个数、疱疹部位及疼痛程度的构成比差异没有统计学意义(均 P>0.05),其疼痛持续时间、最痛评分和疱疹结痂时间差异也没有统计学意义(均 P>0.05)。结论:2017-2021年北京市20岁以下带状疱疹病例以野毒株为优势病原体;未发现水痘疫苗接种对带状疱疹病例的临床特征产生明显影响。

关键词：水痘疫苗带状疱疹后神经痛野毒株疫苗株临床特征监测

原型株及变异株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性评价

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中国生物制品学杂志 2024年第3期37卷 263-266,272页

作者：徐康维许丽鲁旭李晶戈小琴王开芹权娅茹李长贵中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629 北京科兴生物制品有限公司北京100085 北京科兴中维生物技术有限公司北京102601

目的评价原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性。方法分别将原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗经大腿肌内免疫5只雌性Wistar大鼠2次,间隔14 d,免疫剂量均为3μg病毒蛋白/(0.5 mL... 详细信息

目的评价原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性。方法分别将原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗经大腿肌内免疫5只雌性Wistar大鼠2次,间隔14 d,免疫剂量均为3μg病毒蛋白/(0.5 mL·只),初次免疫后14、28和42 d,经静脉采集血,分离血清。间接ELISA法检测血清IgG抗体水平;微量中和试验检测血清中和抗体效价;计算血清中和抗体效价的抗原比,以评价2株病毒间的抗原性差异。结果初次免疫后14 d,全部免疫血清中均可检测到针对4株病毒的IgG抗体,28 d的IgG抗体水平较14 d提高10倍以上,42 d时效价略有下降。首次免疫后14 d,免疫原型株或Delta株疫苗的大鼠血清中,针对4株病毒的中和抗体全部阳转;免疫Beta株和Gamma株疫苗的大鼠血清中,针对Beta株和Gamma株病毒的中和抗体全部阳转,针对原型株或Delta株病毒的中和抗体部分阳转。初次免疫后28 d,4种病毒免疫血清中和抗体均阳转,中和抗体效价较14 d大幅升高;初次免疫42 d时中和抗体效价较28 d总体略有下降。Beta株与Gamma株间、原型株与Gamma株间抗原性差异较小,原型株与Beta株间抗原性差异较大。结论原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARSCoV-2灭活疫苗均能刺激大鼠产生较高效价的中和抗体,但免疫原性有差异。

关键词： SARS-CoV-2 灭活疫苗 IgG抗体中和抗体