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复制型慢病毒VSV-G qPCR检测方法的验证及初步应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第7期41卷 538-544页

作者：吴雪伶赵翔孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)VSV-G qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、... 详细信息

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)VSV-G qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、准确度、线性范围、检测限、定量限及耐用性进行验证。利用所建立的方法进行CAR-T细胞、慢病毒载体生产终末细胞及慢病毒载体收获液样品的初步应用性研究。结果建立的VSV-G荧光定量PCR法,专属性较好,对293T细胞、PBMC细胞及C8166细胞均无特异性扩增,线性范围为1×10^(2)拷贝/test~1×10^(9)拷贝/test,R2能够达到0.998以上,扩增效率在93%~98%之间,精密度RSD<12%,准确度回收率为85%~106%,最低检出限和最低定量限分别为5拷贝/test和40拷贝/test。另外,该方法的耐用性较好。各项验证结果均表明该方法能够满足检测的要求。利用该方法对54批样品(包括CAR-T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞)进行RCL C8166细胞培养法的终点检测,结果显示54批样品均为阴性。结论成功建立了VSV-G实时荧光定量PCR法,各项验证参数均可满足检测要求,该方法的应用将进一步提高慢病毒载体相关产品的安全性。

关键词：复制型慢病毒 VSV-G 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

干细胞临床研究质量复核中发现的问题及初步分析

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中国新药杂志 2021年第19期30卷 1746-1751页

作者：张可华纳涛韩晓燕吴婷婷张丽霞贾春翠袁翔鹤冯建萍项楠孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

自2015年《干细胞临床研究管理办法(试行)》颁布以来,中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心承接了大量的干细胞临床研究细胞制剂质量复核工作,在与干细胞制剂研发机构技术沟通、资料审阅过程中发现了若干在细胞制... 详细信息

自2015年《干细胞临床研究管理办法(试行)》颁布以来,中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心承接了大量的干细胞临床研究细胞制剂质量复核工作,在与干细胞制剂研发机构技术沟通、资料审阅过程中发现了若干在细胞制备工艺、制剂质量标准中存在的问题,在质量复核中也发现在干细胞安全性和干细胞特性检测方面存在多项不符合规定或异常的情况。本文总结了当前本中心在干细胞质量复核中发现的各种情况并进行了简要分析,为干细胞制剂研发生产、质量控制以及临床使用提供参考。

关键词：干细胞干细胞临床研究质量复核

生产用细胞基质中猪细小病毒污染检测方法的建立及应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第4期35卷 127-132页

作者：吴雪伶樊金萍冯建平赵翔孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心、卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、最低检出... 详细信息

目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、最低检出限等参数进行验证，并分析待测样品对试验的干扰。将PPV毒种感染ST细胞，制备病毒。以ST细胞为敏感细胞，建立PPV ST细胞感染性试验，并将ST细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合，建立ST细胞感染-PCR法，分析感染-PCR方法的灵敏度。利用所建立的方法进行生产用细胞样本的初步应用研究。结果 PPV荧光定量PCR法的特异性较好，与其他种属的细小病毒、猴SV40病毒及其他猪源病毒无明显的交叉反应，在109～104拷贝／μl范围内线性较好，R2达到0．98以上，灵敏度为1×10^4拷贝／μl，试验内和试验间的Ct的精密度均＜5％，试验内病毒定量拷贝数的精密度为5％～15％，试验间为30％～40％，最低感染性病毒滴度检测限为1CCID50／ml。待测细胞样品成分对病毒检测无明显的干扰性。 ST细胞感染-PCR法的灵敏度为0．01CCID50／ml。利用荧光定量PCR法对22份细胞样品进行检测，结果均为阴性。结论成功建立了PPV荧光定量PCR检测法及ST细胞感染-PCR法，能够用于细胞中PPV的检测，有助于进一步提高生产用或治疗用细胞的安全性。

关键词：猪细小病毒荧光定量PCR ST细胞感染性试验感染-PCR

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乙型肝炎病毒表面抗原国家定量标准品的研制

中华实验和临床病毒学杂志 2008年第4期22卷 311-313页

作者：吴星周诚辜文洁李河民祁自柏中国药品生物制品检定所疫苗二室北京100050

目的研制乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）国家定量标准品及定量线性参考品。方法收集各地乙型肝炎患者和健康献血员血样，用不同厂家乙型肝炎、丙型肝炎病毒血清学试剂盒筛选。6个协作单位用7种试剂以世界卫生组织（WHO）HBsAg定量标准... 详细信息

目的研制乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）国家定量标准品及定量线性参考品。方法收集各地乙型肝炎患者和健康献血员血样，用不同厂家乙型肝炎、丙型肝炎病毒血清学试剂盒筛选。6个协作单位用7种试剂以世界卫生组织（WHO）HBsAg定量标准品标定1份HBsAg国家定量标准品，稀释后得到HBsAg国家定量线性参考品。结果经7种试剂共21次协作标定，得到HBsAg国家定量标准品的浓度为1226IC／ml，各次检测结果的变异系数均小于15％。将国家定量标准品系列稀释后得到由8个不同浓度血清组成的HBsAg国家线性参考品，经检测后表明其浓度与理论浓度的差值均〈15％，通过加速试验检测该参考品的稳定性效期暂定为5年。将其作为HBsAg国家线性参考品并初步限定检测结果的允许值范围。结论标定1份HBsAg国家定量标准品并建立了由8份血清组成的HBsAg国家定量线性参考品，

关键词：肝炎乙型肝炎表面抗原乙型国家标准品参考标准

基于吲哚胺2,3-双加氧酶1活性评价人间充质干细胞免疫调控功能的吸光光度法的建立及优化

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中国生物制品学杂志 2016年第9期29卷 954-960页

作者：纳涛王盼刘静张可华袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞保藏及研究中心卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立一种基于吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)的活性快速评价人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)免疫调控功能的吸光光度法,并进行优化。方法以含干扰素γ(interferonγ,IFNγ)的完全... 详细信息

目的建立一种基于吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)的活性快速评价人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)免疫调控功能的吸光光度法,并进行优化。方法以含干扰素γ(interferonγ,IFNγ)的完全培养基激活hMSCs,收集hMSCs培养上清,与三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)和对二甲氨基苯甲醛(paradimethylaminobenzaldehyde,PDAB)反应,检测A492值,通过标准曲线计算样品中色氨酸代谢产物犬尿氨酸(kynurenine)的含量,以反映h MSCs所分泌IDO1的酶代谢活性,并对方法中的培养体系(6、12、24、48、96孔板)、IFNγ处理时间(4、8、12、24 h)、培养基使用量(150、200、250、300、350、400、450及500μl)及IFNγ作用浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、5.0及10.0 ng/ml)进行优化。同时验证方法的特异性,并检测样品保存条件及液氮冻存后不同复苏时间对kynurenine浓度的影响。采用优化后的方法分析不同来源、不同代次的hMSCs分泌IDO1的能力。结果确定最佳检测条件为:培养体系为48孔体系,IFNγ处理时间为24 h,培养基使用体积为200μl,IFNγ作用浓度为10.0 ng/ml。该方法可特异性检测IDO1的活性;除常温外,其他样品保存条件对检测结果影响较小;液氮冻存后复苏24 h可检测到与冻存前水平相当的kynurenine。该方法可有效判断不同供体来源的hMSCs在分泌IDO1功能上的差异。结论该方法可快速、特异、稳定地检测hMSCs分泌IDO1的水平,且操作简便,可用于快速评价h MSCs的免疫调控功能。

关键词：吲哚胺2,3-双加氧酶1 间充质干细胞免疫调控功能吸光光度法犬尿氨酸

不同企业生产的HIV抗体确认试剂检测结果的比较

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中国生物制品学杂志 2010年第8期23卷 875-877页

作者：张春涛李秀华宋爱京许四宏聂建辉王佑春中国药品生物制品检定所细胞室北京100050

目的比较3家不同企业生产的HIV抗体确认试剂的检测结果。方法分别应用3家不同企业生产的HIV抗体确认试剂,检测64份经多家HIV抗体酶联免疫试剂检测不一致的样本,比较检测结果的差异,并对不确定样本的常见非特异性条带进行分析。结果 3家... 详细信息

目的比较3家不同企业生产的HIV抗体确认试剂的检测结果。方法分别应用3家不同企业生产的HIV抗体确认试剂,检测64份经多家HIV抗体酶联免疫试剂检测不一致的样本,比较检测结果的差异,并对不确定样本的常见非特异性条带进行分析。结果 3家不同企业生产的HIV抗体确认试剂检测64份样本均为阴性或不确定,但各试剂检测为阴性和不确定样本的比例差别较大,INNO-LIATMHIVI/ⅡScore与NEWLAVBLOT1试剂、INNO-LIATMHIVⅠ/ⅡScore与HIVBLOT2.2试剂及NEWLAVBLOT1与HIVBLOT2.2试剂检测结果的符合率分别为57.8%、28.1%和48.4%,且每两家试剂检测结果之间差异均有统计学意义(P均<0.01)。最易产生不确定结果的条带主要集中在p24和p17上。结论 HIV抗体确认试剂质量差别较大,应加强其质量控制并规范检测标准。

关键词： HIV抗体确认试剂符合率

不同HIV抗体检测试剂检测抗HIV-1膜蛋白抗体的敏感性

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中国生物制品学杂志 2009年第1期22卷 69-71页

作者：李秀华许四宏宋爱京王佑春中国药品生物制品检定所细胞室北京100050

目的分析不同HIV抗体检测试剂检测HIV-1B’和BC重组型膜蛋白抗体的敏感性。方法选择HIV-1B’和BC重组型感染者血浆,用gp41抗原和gp160抗原分别进行亲和层析纯化。将各纯化产物进行系列稀释,用15种HIV抗体ELISA检测试剂以及3种HIV抗原/... 详细信息

目的分析不同HIV抗体检测试剂检测HIV-1B’和BC重组型膜蛋白抗体的敏感性。方法选择HIV-1B’和BC重组型感染者血浆,用gp41抗原和gp160抗原分别进行亲和层析纯化。将各纯化产物进行系列稀释,用15种HIV抗体ELISA检测试剂以及3种HIV抗原/抗体联合检测试剂进行检测。结果用gp41抗原纯化后的样品只含有抗gp160和gp41的抗体带型,而用gp160抗原纯化后的样品含有抗gp160、gp120和gp41的抗体带型。进口试剂检测不同基因型样品的敏感性低于大部分国产试剂,国产试剂检测不同基因型的样品的敏感性无明显差异,而进口试剂检测B’亚型抗体的能力低于检测BC重组型抗体的能力。结论不同基因型的抗体对HIV抗体检测试剂的敏感性可能有一定的影响。

关键词： HIV 膜蛋白抗体基因型检测试剂敏感性

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流感疫苗与格林-巴利综合征

中国生物制品学杂志 2010年第11期23卷 1267-1270页

作者：刘东辉吴星王军志汪兴太美国马塞诸塞公共卫生部实验科学局中国药品生物制品检定所北京100050

格林-巴利综合征(Guillan-Barré syndrome,GBS)是微生物(细菌和病毒等)感染或其他因素诱导所致的针对外周神经系统脱髓鞘炎的自身免疫反应。大范围接种H1N1流感疫苗所致严重GBS已引起人们对流感疫苗罕见不良反应的关注。本文就GBS的历... 详细信息

格林-巴利综合征(Guillan-Barré syndrome,GBS)是微生物(细菌和病毒等)感染或其他因素诱导所致的针对外周神经系统脱髓鞘炎的自身免疫反应。大范围接种H1N1流感疫苗所致严重GBS已引起人们对流感疫苗罕见不良反应的关注。本文就GBS的历史、临床特征、研究现状、与流感疫苗的相关性、流感疫苗接种的意义及其不良反应监控等作一综述。

关键词：流感疫苗格林-巴利综合征流感病毒

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流感疫苗中血凝素定量检测方法的评价

中华微生物学和免疫学杂志 2010年第1期30卷 85-88页

作者：袁力勇宋颖丽李长贵黎旭光中国药品生物制品检定所北京100050 武汉生物制品研究所加拿大卫生部生物制品质量研究中心

流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲、乙型流感病毒的基因组均含8个节段，丙型流感病毒含7个节段。甲、乙型流感病毒的8个基因节段分别编码血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）、三种多聚酶蛋白（PB1、PB2、P... 详细信息

流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲、乙型流感病毒的基因组均含8个节段，丙型流感病毒含7个节段。甲、乙型流感病毒的8个基因节段分别编码血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）、三种多聚酶蛋白（PB1、PB2、PA）和非结构蛋白（NS）。

关键词：定量检测方法血凝素流感疫苗乙型流感病毒神经氨酸酶非结构蛋白基质蛋白基因组