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利用复合酶制备低聚甘露糖

食品与发酵工业 2015年第8期41卷 105-110页

作者：史红玲焦铸锦唐存多王瑞姚伦广阚云超邬敏辰南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室江南大学无锡医学院江苏无锡214122

为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖... 详细信息

为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖酶(re Au Cel12A)对魔芋精粉进行水解。通过研究不同酶的添加比例、酶解p H值、酶解时间、酶解温度和底物浓度等因素,获得复合酶最佳的复配比例及酶解工艺条件。同时研究了保护剂对复合酶稳定性的影响。研究结果表明:复合酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:用去离子水配制的30 g/L魔芋胶溶液,re Au Man5AN3C3和re Au Cel12A配比为1∶1.5(前者为60 U/g魔芋精粉),水解温度为60℃,水解时间为6 h,在此条件下魔芋精粉的水解率可达65%。薄层层析分析结果显示魔芋精粉经酶水解后产物主要是二糖以上的寡糖,且主要介于二糖与六糖之间,无单糖的产生。在有保护剂存在的情况下,复合酶在室温下存放2个月其残余酶活均能超过85%。

关键词：低聚甘露糖 β-甘露聚糖酶 β-1,4-内切葡聚糖酶水解率魔芋精粉

组蛋白H3Thr3磷酸化在Sf9细胞有丝分裂中的动态定位

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昆虫学报 2018年第11期61卷 1247-1252页

作者：张冰徐茜唐存多王姣玲吴盼盼朱露露阚云超南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室昆虫生物反应器河南省工程实验室中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室河南南阳473061

【目的】研究组蛋白H3Thr3磷酸化这一表观标记在Sf9细胞有丝分裂中的功能。【方法】通过固相法合成一段包含组蛋白H3第1-9位氨基酸的肽段[ARTKQTARKC],将第3位苏氨酸进行磷酸化修饰(P-Pep 226555)或者不修饰(NP-Pep 080472)后制备抗体,W... 详细信息

【目的】研究组蛋白H3Thr3磷酸化这一表观标记在Sf9细胞有丝分裂中的功能。【方法】通过固相法合成一段包含组蛋白H3第1-9位氨基酸的肽段[ARTKQTARKC],将第3位苏氨酸进行磷酸化修饰(P-Pep 226555)或者不修饰(NP-Pep 080472)后制备抗体,Western blot检测抗体的特异性。培养Sf9细胞,通过爬片制备细胞处于有丝分裂不同时期的玻片,以免疫荧光标记检测磷酸化H3Thr3(H3Thr3ph)抗体在Sf9细胞有丝分裂不同时期的定位特点。【结果】在Sf9细胞中,组蛋白H3Thr3的磷酸化发生在前期细胞染色体的特定位置;随着细胞周期的进行,磷酸化信号逐渐增强,中期达到最高水平,有丝分裂后期在形成子细胞的赤道板处均匀分布,末期仅在赤道板特定位置残留微弱的磷酸化信号。【结论】H3Thr3的磷酸化与Sf9细胞胞质有丝分裂相关。

关键词： Sf9细胞组蛋白H3 磷酸化有丝分裂免疫荧光胞质分裂

家蚕化学感受蛋白CSP16的表达及结合特性分析

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昆虫学报 2016年第6期59卷 613-621页

作者：郭兴国陈莹邢秋婷邢万静阚云超乔惠丽南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室昆虫生物反应器河南省工程实验室中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室河南南阳473061

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学信号的感受识别和生长发育调节等生理过程具有重要作用。本研究旨在探索CSP16在家蚕Bombyx mori中的功能。【方法】利用RT-q PCR分析csp16在家蚕不同发育时期和不同组织的... 详细信息

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在昆虫化学信号的感受识别和生长发育调节等生理过程具有重要作用。本研究旨在探索CSP16在家蚕Bombyx mori中的功能。【方法】利用RT-q PCR分析csp16在家蚕不同发育时期和不同组织的表达特征,用原核表达系统对家蚕CSP16进行表达纯化,并通过荧光结合实验检测该蛋白与不同配体化合物的结合特性。【结果】RT-q PCR结果表明,csp16在家蚕1-5龄幼虫中呈规律性表达,各龄期眠蚕中表达量最高,5龄第3天幼虫中主要表达于头、表皮、精巢和卵巢等。蜕皮激素(20E)处理后csp16在不同龄期幼虫和5龄幼虫不同组织中的表达量上调。纯化后CSP16的荧光结合实验表明,CSP16与醇类、酯类、醛类、酚类和苯环类等化合物的亲和力都较弱。【结论】csp16在家蚕不同龄期幼虫眠蚕中表达量最高,蜕皮激素使csp16在家蚕取食幼虫中的表达量出现上调,提示其可能参与家蚕幼虫的蜕皮过程。

关键词：家蚕化学感受蛋白 RT-qPCR分析蜕皮激素结合特征

组蛋白H3Ser10磷酸化在家蚕精母细胞减数分裂中的动态分布

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昆虫学报 2021年第3期64卷 302-308页

作者：张冰邱礽阚云超南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室昆虫生物反应器河南省工程实验室中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室河南南阳473061

【目的】探究组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)在家蚕Bombyx mori精母细胞减数分裂中的功能。【方法】解剖并分离家蚕4龄幼虫至蛹期精巢组织,通过丙烯酰胺凝胶包埋制备处于减数分裂不同时期的精巢组织玻片,以免疫荧光标记检测H3Ser10ph... 详细信息

【目的】探究组蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)在家蚕Bombyx mori精母细胞减数分裂中的功能。【方法】解剖并分离家蚕4龄幼虫至蛹期精巢组织,通过丙烯酰胺凝胶包埋制备处于减数分裂不同时期的精巢组织玻片,以免疫荧光标记检测H3Ser10ph抗体在精母细胞减数分裂不同时期的定位特点。【结果】在家蚕有核精子精母细胞减数分裂过程中,组蛋白H3Ser10的磷酸化发生在粗线期染色体的特定位置,双线期H3Ser10ph信号逐渐减弱,至终变期时在染色体上完全检测不到磷酸化信号。随着细胞周期的进行,磷酸化信号又开始逐渐增强,减数第一次分裂中期时达到最高水平。当细胞进入减数第二次分裂前中期时,染色体臂上的H3Ser10ph信号消失,在靠近纺锤体微管的分裂面处有弥散的H3Ser10ph抗体的信号,减数第二次分裂末期,仅剩余非常微弱的H3Ser10ph信号残留于染色体的特定位置。在无核精子精母细胞减数分裂过程中,在中期Ⅰ至末期Ⅰ一直在染色体上有较均一的H3Ser10ph信号,后期Ⅰ时纺锤丝微管与赤道面平行。【结论】组蛋白H3Ser10磷酸化与家蚕有核精子和无核精子精母细胞减数分裂中染色质的动态变化相关。

关键词：家蚕 H3Ser10磷酸化减数分裂有核精子无核精子细胞周期

组蛋白H3Ser10磷酸化在草地贪夜蛾Sf9细胞有丝分裂中的动态分布

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昆虫学报 2017年第11期60卷 1278-1284页

作者：王姣玲马亚飞王霜阚云超张冰南阳师范学院河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室昆虫生物反应器河南省工程实验室中英南阳洛桑昆虫生物学联合实验室河南南阳473061

【目的】探讨表观遗传标记组蛋白H3Ser10磷酸化在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞系细胞有丝分裂中的功能。【方法】序列比对分析组蛋白H3保守性。通过固相法合成特定位点磷酸化修饰的一段组蛋白H3的肽段【RK(p S)TGGKAPRKQLC... 详细信息

【目的】探讨表观遗传标记组蛋白H3Ser10磷酸化在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9细胞系细胞有丝分裂中的功能。【方法】序列比对分析组蛋白H3保守性。通过固相法合成特定位点磷酸化修饰的一段组蛋白H3的肽段【RK(p S)TGGKAPRKQLC】进行抗体制备;培养Sf9细胞,通过细胞爬片制备有丝分裂的片子,统计不同时期的细胞数目;以免疫荧光标记检测组蛋白H3Ser10磷酸化抗体在不同时期的定位特点。【结果】序列比对分析发现组蛋白H3第1-60位氨基酸在大多数物种中高度保守。在草地贪夜蛾Sf9细胞中,组蛋白H3Ser10磷酸化发生在早前期细胞的核膜附近,成点状分布;随着细胞周期的进行,早中期达到最高水平,在整条染色体上集中分布。有丝分裂后期开始去磷酸化,并于末期完成去磷酸化。【结论】组蛋白H3Ser10磷酸化与Sf9细胞有丝分裂中染色质的凝缩相关。

关键词： Sf9细胞系组蛋白H3 磷酸化有丝分裂免疫荧光标记染色质凝缩

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环介导等温扩增技术检测食品安全的研究进展

中国生物工程杂志 2018年第11期38卷 84-91页

作者：王静许鑫王雪雨姚伦广阚云超冀君南阳师范学院南阳市兽医生物工程技术研究中心/南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室

食品安全一直是全世界公众健康的关注焦点。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的等温核酸扩增技术,近年来在核酸检测领域有着广泛的研究和应用。将LAMP技术应用到食... 详细信息

食品安全一直是全世界公众健康的关注焦点。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异性强、灵敏度高、快速简便的等温核酸扩增技术,近年来在核酸检测领域有着广泛的研究和应用。将LAMP技术应用到食品安全检测领域,可以快速准确的监控一些食品安全问题,避免对人类健康所构成的危害。因此针对LAMP技术在食品安全检测方面的优势进行分析,并结合LAMP技术与新兴诊断技术平台的联合运用进行了展望。

关键词：环介导等温扩增食品安全核酸检测联合应用

新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表达鉴定

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食品科学 2016年第11期37卷 90-96页

作者：唐存多史红玲蔚晓华张梅唐青海岳超姚伦广夏敏阚云超南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室河南南阳473061 南阳师范学院生命科学与技术学院河南南阳473061 蓬莱市市场监督管理局山东蓬莱265600

为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借... 详细信息

为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。

关键词： β-甘露聚糖酶基因挖掘生物信息学分析米曲霉蛋白表达

鸡贫血病毒凋亡素基因的可溶性融合表达及抗肿瘤活性分析

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中国生物工程杂志 2017年第2期37卷 26-32页

作者：冀君朱晨晨许鑫刘晓冷超粮史鸿飞姚伦广阚云超南阳师范学院南阳市兽医生物工程技术研究中心/南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室南阳473061

为获得高效可溶表达的鸡贫血病毒凋亡素基因(CAV-Apoptin),根据大肠杆菌密码子偏爱性优化CAV-Apoptin基因序列,将其连接到含msyB伴侣基因的pBCX载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后应用镍柱亲和层析纯化蛋白质... 详细信息

为获得高效可溶表达的鸡贫血病毒凋亡素基因(CAV-Apoptin),根据大肠杆菌密码子偏爱性优化CAV-Apoptin基因序列,将其连接到含msyB伴侣基因的pBCX载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用显微镜观察、CCK-8实验与DNA ladders测定其抗肿瘤细胞的活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pBCX-CAV-Apoptin,在37℃正常培养条件下的大肠杆菌中得到大量可溶性表达产物,融合蛋白质分子量大小约为42 kDa,50 ml菌液即可获得1.5 mg左右的纯化重组蛋白,CCK-8实验结果显示纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细胞生长产生超过60%的抑制率;显微镜观察与DNA ladder实验证明重组蛋白可诱导JEKO-1、REC-1细胞的凋亡,对HUVEC没有诱导凋亡的作用。免疫印迹分析表明重组凋亡素对JEKO-1细胞诱导了Caspase-3的激活,而对Caspase-8的表达没有影响。研究表明融合蛋白msyB-CAV-Apoptin可达到高效可溶表达,且表达产物具有特异抗肿瘤活性。

关键词：凋亡素鸡贫血病毒融合伴侣高效可溶性表达活性分析

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甲酸脱氢酶催化活性的定向进化及其高效表达

应用化学 2021年第6期38卷 704-712页

作者：张振华解玉丽王铁军赵虹唐存多阚云超姚伦广南阳师范学院昆虫生物反应器河南省工程实验室河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室南阳473061 河南蓝图制药有限公司南阳473061

甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)属于D-2-羟基酸脱氢酶类,能催化甲酸氧化生成二氧化碳,同时能将氧化型辅酶I(Oxdized form of nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)还原成还原型辅酶I(Redued form of nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),在NADH的再生中起重要作用。为了获得高活性的甲酸脱氢酶突变体,本研究以博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶(Candida boidinii formate dehydrogenases,CbFDH)突变体(CbFDHC23S)为亲本,进行了2轮定向进化,获得了一个比酶活性约为亲本4倍,且更适合于在生理条件下进行辅酶再生的突变体M2。然后,利用计算机辅助的手段初步阐明了其温度特性和催化效率改变的分子机制。最后,借助共表达策略进一步提高了突变体M2在大肠杆菌中的表达水平,超声裂解液中的甲酸脱氢酶活性达到45.85 U/mL,远远高于亲本单拷贝表达水平。本研究为增强NADH再生能力、降低NADH的再生成本,实现FDH偶联催化的手性醇及氨基酸衍生物等食品添加剂高效、廉价的绿色生物合成奠定理论基础。

关键词：甲酸脱氢酶催化效率定向进化分子对接高效表达