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肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 169-176页

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆400038 重庆大学医学院重庆400044

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况。将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17~19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40 nnmol/L,每孔500μl)的组别。经4%多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色IFKineTM荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况。取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BL/6小鼠,为CVF组;并设置C3-/-组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BL/6小鼠)。取10000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示。以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)10只、C3aR^(-/-)小鼠10只;1000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR^(-/-)小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)6只和C5aR^(-/-)小鼠6只,感染后3 d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止。采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验。结果PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81细胞株内扩增出C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和C5aR(374 bp)基因。Western blotting检测结果发现,两种细胞均有C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达。激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR^(-/-)小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR^(-/-)小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre^(+/+)C5aR^(flox/flox)小鼠和C5aR^(-/-)小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

基于肠道菌群探讨营养干预2型糖尿病的研究进展

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生命科学 2024年第4期36卷 499-508页

作者：王蕊蕊党冬梅延安大学医学院延安716000 延安大学医学院病原生物学教研室延安716000

2型糖尿病(T2DM)发病机制复杂,由多方面因素共同作用形成,以持续性高血糖为主要特征。肠道微生物群是人体肠道内由细菌、古菌、病毒和真核微生物等组成的庞大系统,参与并影响机体的物质和能量代谢。研究发现,肠道菌群可通过影响短链脂... 详细信息

2型糖尿病(T2DM)发病机制复杂,由多方面因素共同作用形成,以持续性高血糖为主要特征。肠道微生物群是人体肠道内由细菌、古菌、病毒和真核微生物等组成的庞大系统,参与并影响机体的物质和能量代谢。研究发现,肠道菌群可通过影响短链脂肪酸、胆汁酸、支链氨基酸、脂多糖等间接导致胰岛素抵抗和胰岛素敏感性降低,影响T2DM的发生发展。而营养干预是治疗糖尿病的基础手段,可有效调节肠道菌群平衡使之维持稳态,间接调节胰岛素的生成,有效改善血糖。本文综述了肠道菌群在T2DM发生发展中的作用机制,分析营养干预肠道菌群改善T2DM的研究进展,以期为通过调控肠道菌群治疗T2DM提供新思路,为精准的个性化营养干预提供参考。

关键词：肠道菌群营养干预 2型糖尿病胰岛素抵抗发病机制

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结核病蛋白亚单位疫苗佐剂研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2024年第6期44卷 489-500页

作者：周帅牛红霞浙江中医药大学基础医学院病原生物与免疫学教研室杭州310053

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球传染病,是导致人类死亡的十大主要原因之一。卡介苗(BCG)是目前唯一临床应用的结核病疫苗,但其对成人结核病的保护作用不明确。在结核病新型疫苗中,蛋白亚单位疫苗因其成分明确、安全性高的特点,... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球传染病,是导致人类死亡的十大主要原因之一。卡介苗(BCG)是目前唯一临床应用的结核病疫苗,但其对成人结核病的保护作用不明确。在结核病新型疫苗中,蛋白亚单位疫苗因其成分明确、安全性高的特点,且具有强化BCG效应的优势,近年来备受关注。然而,亚单位结核病疫苗中的蛋白抗原所诱导的免疫应答较弱,通常需要佐剂辅助以增强其免疫效果。本综述旨在关注结核病疫苗新制剂中使用的各类佐剂(包括已进入临床试验阶段和尚处于临床前开发阶段的佐剂),对各类佐剂的优缺点及可应用性进行客观评价,并指出目前佐剂研究中存在的问题及未来的研究方向。

关键词：结核病亚单位疫苗佐剂中药佐剂

ADAR1 p150和p110参与肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

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重庆医科大学学报 2024年第7期49卷 820-829页

作者：巩雪柳静蹇文文崔易红涂增重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室重庆400016

目的:研究腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)对肝细胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)增殖、迁移与侵袭的影响。方法:利用基因表达谱交互式分析网站GEPIA检测ADAR1在LIHC中的表达水平和预后价值;提取人体肝癌标本的蛋白,通过Western blot实验检测ADAR1的表达情况。将ADAR1 p150和p110过表达质粒和靶向ADAR1 p150和p110的小干扰RNA分别转染进HepG2和Huh7细胞,利用Western blot和qPCR检测转染后细胞的ADAR1表达情况。通过CCK-8实验检测ADAR1对肝癌细胞增殖能力的影响。通过细胞划痕实验和Transwell实验检测ADAR1对肝癌细胞迁移和侵袭的影响。最后,在DAVID在线数据库中分析与ADAR1相关的信号通路,利用Western blot实验检测信号通路中相关蛋白的表达。结果:肝癌组织中ADAR1蛋白质水平明显高于癌旁组织,这与生物信息学的预测一致,且高表达的ADAR1与肝癌的不良预后相关;通过CCK-8实验,本研究发现过表达ADAR1可以促进肝癌细胞的增殖能力(P<0.05),敲低ADAR1使肝癌细胞增殖能力下降(P<0.05)。通过划痕和Transwell实验,本研究发现ADAR1的过表达促进了肝癌细胞的迁移和侵袭(P<0.05),敲低ADAR1后,肝癌细胞迁移和侵袭能力受到抑制(P<0.05)。DAVID在线分析结果显示,ADAR1主要富集在Wnt信号通路中。Western blot结果提示,过表达ADAR1抑制GSK3β表达和β-catenin的磷酸化水平,敲低ADAR1后GSK3β表达和β-catenin的磷酸化水平升高。结论:本研究结果表明,ADAR1在肝癌中处于高表达水平,可激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进肝癌的增殖、迁移和侵袭。

关键词：腺苷脱氨酶1 肝癌增殖迁移侵袭 Wnt/β-catenin信号通路

云南松松塔粗提物体外抗拉沙病毒活性及机制的研究

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中国人兽共患病学报 2024年

作者：刘贞麟张曼琳刘奇王聪大理大学基础医学院病原生物学综合实验室

目的研究云南松松塔粗提物抗拉沙病毒（LASV）活性及机制。方法利用拉沙假病毒系统及拉沙细胞-细胞融合检测松塔粗提物抗LASV活性。其中,构建拉沙假病毒系统以慢病毒骨架质粒***.R-E.与含有拉沙包膜蛋白质粒转染于293T细胞,生成了一... 详细信息

目的研究云南松松塔粗提物抗拉沙病毒（LASV）活性及机制。方法利用拉沙假病毒系统及拉沙细胞-细胞融合检测松塔粗提物抗LASV活性。其中,构建拉沙假病毒系统以慢病毒骨架质粒***.R-E.与含有拉沙包膜蛋白质粒转染于293T细胞,生成了一种含有荧光素酶报告基因的假性拉沙病毒。可以在BSL-2级生物安全实验室中检测松塔粗提物抗LASV活性的研究。其次,拉沙细胞-细胞融合模型的构建是通过对已有的质粒进行酶切,连接,鉴定,获得重组质粒,编码带有荧光报告基因及拉沙包膜蛋白的质粒（PAAV-EGFP-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）将其转染至293T细胞,获得表面表达有拉沙包膜蛋白的荧光细胞,与靶细胞huh7细胞混合铺于96孔板,在37℃,酸性件下发生膜融合,后续用膜融合系统来检测松塔粗提物抗LASV活性研究;对松塔粗提物作用于LASV假病毒感染的具体时期进行分析,通过time of addition及time of remove试验分析松塔粗提物抗病毒作用靶点;采用Weston-blot方法检测p24蛋白量,判断松塔粗提物对病毒的裂解作用。结果松塔粗提物可有效抑制LASV感染,用4个谱系的LASV假病毒（LASV lineagesⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）感染靶细胞,测得IC50值分别为:42.06μg/mL、22.26μg/mL、80.57μg/mL及19.32μg/mL,抑制LASV包膜蛋白（GPC）介导的细胞-细胞融合活性的检测,测得IC50值分别为:122.9μg/mL、64.43μg/mL、90.05μg/mL及195.6μg/mL;松塔粗提物具有广谱抗病毒作用,可有效抑制沙粒病毒属:淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、卢霍病毒及胡宁病毒假病毒感染,IC50值分别为:2.716μg/mL、12.02μg/mL、29.95μg/mL;松塔粗提物作用于LASV假病毒感染早期,于感染后2 h内加入粗提物的抑制率明显高于4 h后加入药物,且以阻断LASV假病毒的吸附及融合为主;松塔粗提物对LASV假病毒无裂解作用,提取物处理组测得p24蛋白含量与未处理组无显著差异。结论本研究证实云南松松塔粗提物在体外环境下可有效抑制LASV感染,且具有广谱抗病毒作用;经试验结果证实松塔粗提物主要作用于病毒感染早期,以阻断病毒的吸附及融合为主,为松塔提取物抗LASV的深入研究提供重要的参考依据。

关键词：云南松松塔粗提物拉沙病毒抗病毒活性抗病毒机制

基于酵母双杂交技术对与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒σNS相互作用宿主蛋白的筛选

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1313-1321页

作者：孙绿茵马竹萍李润林李永刚陶晓莉锦州医科大学基础医学院病原生物学教研室辽宁锦州121000

目的:探讨小鼠成纤维L929细胞中与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒(NBV)σNS蛋白相互作用(互作)的宿主蛋白,阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法:构建表达σNS蛋白的诱饵质粒pGBKT7-S3,采用测序技术验证诱饵质粒在Y2H酵母细胞中的准确表达。将pG... 详细信息

目的:探讨小鼠成纤维L929细胞中与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒(NBV)σNS蛋白相互作用(互作)的宿主蛋白,阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法:构建表达σNS蛋白的诱饵质粒pGBKT7-S3,采用测序技术验证诱饵质粒在Y2H酵母细胞中的准确表达。将pGBKT7-S3和pGADT7质粒分别和共同转化至Y2HGold酵母细胞中,涂布于固体培养基进行培养,观察菌落生长情况,确认σNS蛋白对酵母细胞无毒性,不能自行激活报告基因。诱饵质粒pGBKT7-S3与小鼠成纤维L929细胞的cDNA文库进行杂交,对编码互作蛋白的阳性克隆进行质粒抽提,阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到与NBVσNS互作的蛋白。对互作蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析和STRING生物信息学分析。结果:成功筛选出61个阳性克隆。DNA测序分析和BLAST比对分析去除23个未匹配到数据库和测序基本相同的阳性克隆。阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到38个与NBVσNS互作的蛋白,31个蛋白参与细胞生物过程,36个蛋白是细胞解剖成分,31个蛋白具有结合功能,5个蛋白是线粒体呼吸链组成部分,7个蛋白是核糖体蛋白和核糖体大小亚基的组成部分,2个蛋白参与铁代谢稳态。GO功能富集分析,互作蛋白参与的生物过程(BP)富集在细胞过程、代谢过程、生物学调节、定位和对刺激的反应等;细胞组分主要是细胞解剖成分和含蛋白复合物;分子功能集中在结合、催化活性、结构分子活性和转运活性等方面。KEGG信号通路富集分析,蛋白在遗传信息处理途径的翻译、折叠、分类和降解信号通路中高度富集,在机体系统中主要与消化系统有关联;与多种病毒性传染病和癌症有关联。STRING分析,互作蛋白涉及核糖体蛋白类、蛋白修饰类、代谢类和免疫蛋白类等功能蛋白。结结论论:成功筛选出与NBVσNS蛋白互作的蛋白,宿主蛋白在病毒复制中具有重要作用。

关键词：纳尔逊海湾正呼肠孤病毒酵母双杂交实验 σNS蛋白蛋白互相作用生物信息学

千层纸素A调控胆碱能抗炎通路抑制结核分枝杆菌致巨噬细胞焦亡

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第5期44卷 423-430页

作者：张贺敏沈晶晶刘芳琳吴鉴超刘亚奇姜昕上海中医药大学中西医结合学院免疫学与病原生物学教研室上海201203

目的探讨千层纸素A(oroxylin A,OrA)对结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞焦亡的作用及分子机制。方法构建结核分枝杆菌感染J774A.1细胞体外模型;MTT法检测OrA对J774A.1细胞活力的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检... 详细信息

目的探讨千层纸素A(oroxylin A,OrA)对结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞焦亡的作用及分子机制。方法构建结核分枝杆菌感染J774A.1细胞体外模型;MTT法检测OrA对J774A.1细胞活力的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测细胞LDH释放水平;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、GSDMD-N、caspase1-p20、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、α7烟碱乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)蛋白质表达水平及NF-κB p65的磷酸化。ELISA检测各组细胞IL-1β表达水平;免疫荧光检测α7nAChR蛋白及定位。结果MTT结果表明OrA在80μmol/L浓度范围内对J774A.1细胞无细胞毒性;OrA抑制J774A.1细胞LDH的释放,降低细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N、caspase1-p20的蛋白质表达水平以及ASC寡聚化,促进α7nAChR蛋白表达,并抑制NF-κB p65磷酸化和IL-1β的释放;加入α7nAChR激动剂PNU282987可降低GSDMD-N并抑制NF-κB p65磷酸化。结论OrA可能通过调控胆碱能抗炎通路抑制结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞焦亡。

关键词：细胞焦亡千层纸素A 结核分枝杆菌宿主导向疗法 α7烟碱乙酰胆碱受体

八年制医学整合课程《感染与免疫前沿进展》的教学实践与思考

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细胞与分子免疫学杂志 2024年

作者：雷迎峰吕欣柏银兰庄然徐志凯张瑞陈丽华张芳琳空军军医大学基础医学院:微生物与病原生物学教研室空军军医大学基础医学院:免疫学教研室

医学整合课程是现代医学教育模式发展变革的重要模式之一，以模块为单元的整合课程对知识、能力与素质目标提出了更高要求。空军军医大学八年制医学整合课程《感染与免疫前沿进展》教学改革实践包括教学内容的选择与整合，多种教学方法... 详细信息

医学整合课程是现代医学教育模式发展变革的重要模式之一，以模块为单元的整合课程对知识、能力与素质目标提出了更高要求。空军军医大学八年制医学整合课程《感染与免疫前沿进展》教学改革实践包括教学内容的选择与整合，多种教学方法的创新应用，多元化教学评估与反馈和教学团队建设。该课程不仅拓展了学生的知识深度，促进学生的能力发展，还提升了学生的综合素养和国际视野，培养的高素质医学人才能够适应未来医学发展需要。

关键词：八年制医学整合课程感染与免疫前沿进展教学内容教学评估教学团队

新型肠炎沙门菌菌影候选疫苗在小鼠免疫应答和保护功效的评估

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第4期44卷 295-303页

作者：杨慧韩雪杜小春焦红梅郑国军常州市第三人民医院检验科常州213000 扬州大学医学院/转化医学研究院病原生物学教研室扬州225001

目的比较肠炎沙门菌制备的菌影(SE-ghost)通过肌肉注射(肌注)和口服不同免疫途径接种雌性BALB/c小鼠诱导体液和细胞免疫应答的功效。方法用SE-ghost接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道灌洗液IgA抗体水平;流式细... 详细信息

目的比较肠炎沙门菌制备的菌影(SE-ghost)通过肌肉注射(肌注)和口服不同免疫途径接种雌性BALB/c小鼠诱导体液和细胞免疫应答的功效。方法用SE-ghost接种BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道灌洗液IgA抗体水平;流式细胞仪检测小鼠脾脏CD3^(+)CD4^(+)T、CD3^(+)CD8^(+)T细胞百分比变化和脾脏内细胞因子IL-4、IFN-γ分泌;三次免疫后所有小鼠口服半数致死量肠炎沙门菌进行强毒攻击。用SE-ghost刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs),流式细胞仪检测表面分子抗体APC-CD11c、FITC-MHC ClassⅡ、PE-CD40、FITC-CD86、PE-CD80表达量;双抗体夹心ELISA测定BMDCs上清液IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12p70的产量。结果与PBS组相比,SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组小鼠体内肠炎沙门菌特异性抗体IgG和IgA水平明显增高;脾脏CD3^(+)CD4^(+)T细胞百分比上调、高分泌细胞因子IL-4、IFN-γ。肌肉注射SE-ghost比口服可诱导更强的体液和细胞免疫应答。致病菌肠炎沙门菌强毒攻击后,SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组生存率高达80%。与对照组相比,BMDCs经SE-ghost刺激后高表达表面成熟分子抗体CD86、CD80、CD40、MHCⅡ,高分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70。结论通过肌肉注射SE-ghost进行免疫,可在小鼠中引发更强大的抗原特异性免疫应答,以防止沙门菌感染。SE-ghost是一种有用的沙门菌候选疫苗。

关键词：肠炎沙门菌细菌菌影灭活疫苗免疫应答保护功效