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马尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析

林业科学 2020年第3期56卷 184-192页

作者：武星胡兴峰陈佩珍孙晓波吴帆季孔庶南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南方现代林业协同创新中心南京210037

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用... 详细信息

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914 bp,包含2085 bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10 nmol·L^-1时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2 nmol·L^-1时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。

关键词：马尾松 PmPIN1基因转基因功能分析

毛果杨Rubisco活化酶基因的克隆与功能分析

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林业科学 2017年第4期53卷 83-95页

作者：尹吴孙伟博周燕诸葛强南京林业大学南方现代林业协同创新中心林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高... 详细信息

【目的】核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是参与植物光合作用的第1步碳同化的关键酶,而Rubisco活化酶(RCA)能够使Rubisco处于稳定的催化活性状态,从而提高光合效率。本研究从毛果杨中克隆RCA基因并通过遗传转化南林895杨,获得PtRCA高表达的转基因株系,并进行分子检测及相关功能分析,为培育杨树新型高光效抗逆品种提供依据。【方法】基于毛果杨基因组数据库信息克隆PtRCA基因序列,利用生物信息学对PtRCA基因进行功能和结构分析。采用Gateway技术将PtRCA构建到植物表达载体pGWB406中,以南林895杨为受体材料,通过农杆菌介导法进行遗传转化。以转PtRCA基因南林895杨和对照(南林895杨)为材料,测定分析在高温胁迫下转基因植株的基因表达、光合参数和叶绿素荧光参数的差异。【结果】从毛果杨中克隆获得PtRCA的CDS序列长1 323 bp,编码440个氨基酸残基,其蛋白相对分子质量为48 315.9 Da,等电点pI为5.57,为疏水性蛋白,无信号肽以及跨膜结构;通过序列对比,发现PtRCA属AAA+超级家族一员,且与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。转PtRCA基因南林895杨RCA表达量均高于对照,且能够利用强光充分进行光合作用,其光饱和点也均高于对照,增加约12.5%~37.5%;光补偿点除3号株系外,其他转基因株系均略低于对照;转基因植株在光饱和点的光合速率比对照增高24.6%~55.7%。转基因株系对CO_2的利用能力和羧化效率均强于对照组,CO_2饱和点除1号和4号株系外,其他株系均比对照低12.5%~25.0%;CO_2补偿点比对照降低53.1%~80.4%;光呼吸比对照低37.7%~79.3%,并且转基因杨树在CO_2饱和点的光合速率比对照增高4.4%~26.4%。另外,转基因杨树表现出耐光氧化的能力,光氧化处理后,对照PSⅡ原初光化学效率下降61.7%,而转基因杨树下降45.0%~53.1%;对照PSⅡ实际光化学效率下降54.1%,而转基因杨树下降38.7%~52.0%;光化学猝灭系数对照下降68.3%,而转基因杨树下降51.0%~65.8%;非光化学猝灭系数对照仅增加3.0%,而转基因杨树增加6.0%~26.5%。【结论】杨树Rubisco活化酶(PtRCA)蛋白与大豆、拟南芥RCA蛋白同源性较高。通过实时定量及相关生理分析表明,转PtRCA基因南林895杨具耐高温特性,利用CO_2和强光进行光合作用的能力较强,催化Ru BP进行羧化反应的效率较高。转PtRCA基因杨树能够充分利用吸收的光子,PSⅡ反应中心效率较高,过剩光能量得到较好的耗散,表现出耐光氧化的能力。研究结果表明,PtRCA基因的高效表达提高了转基因植株的光合效率,并对高温高光强具有调节能力。

关键词：杨树 Rubisco活化酶基因转基因光合作用

杂交鹅掌楸体胚再生植株淹水胁迫下叶片超微结构及光合特性变化

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林业科学 2018年第3期54卷 19-28页

作者：周艳威陈金慧鲁路成铁龙杨立明施季森南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037 南京林业大学生物与环境学院南京210037

【目的】研究不同淹水胁迫处理时间下杂交鹅掌楸植株表型、叶绿体超微结构及光合特性的响应变化,揭示杂交鹅掌楸在淹水胁迫下的响应机制,为其栽培管理和多涝害地区的应用推广提供理论依据。【方法】以无菌培养条件下3~5个叶片的杂交鹅... 详细信息

【目的】研究不同淹水胁迫处理时间下杂交鹅掌楸植株表型、叶绿体超微结构及光合特性的响应变化,揭示杂交鹅掌楸在淹水胁迫下的响应机制,为其栽培管理和多涝害地区的应用推广提供理论依据。【方法】以无菌培养条件下3~5个叶片的杂交鹅掌楸体胚再生植株为研究对象,采用无菌水完全淹没植株的方法模拟水淹灾害,以正常培养条件为对照,研究不同淹水胁迫处理时间(1、3、5、7和7天后恢复处理2天)下杂交鹅掌楸植株表型、光合特性的响应变化以及对叶绿体超微结构的影响。【结果】1)在不同时间的淹水胁迫处理中,杂交鹅掌楸体胚植株受涝害的程度随着淹水时间的延长而明显加重;植株叶片从基部开始卷曲、黄化甚至脱落,但顶芽无明显变化,这可能是杂交鹅掌楸在淹水胁迫中启动相应保护机制以应对淹水胁迫环境。2)淹水胁迫处理过程中叶绿体肿胀变形,膜系统严重损伤,甚至降解,基粒和基质片层堆叠紊乱,淀粉粒不断积累,嗜锇颗粒电子密度增大,胁迫后期出现聚集现象,说明淹水胁迫导致杂交鹅掌楸叶绿体超微结构严重破坏。3)淹水胁迫处理过程中净光合速率、气孔导度和蒸腾速率呈明显下降趋势,而细胞间CO_2浓度呈缓慢上升趋势;光系统Ⅱ的光合电子传递速率、光化学淬灭系数、最大光化学效率和光化学实际量子产量均呈现显著下降趋势,淹水7天并恢复处理2天后光合作用特性参数出现一定程度的恢复,这表明淹水胁迫使杂交鹅掌楸关闭了与外界进行气体交换的气孔通道,并对光系统Ⅱ活性中心造成严重损伤。【结论】长时间淹水胁迫可引起杂交鹅掌楸叶绿体超微结构的破坏,进而损伤光系统Ⅱ反应中心,进而光能转换效率降低,造成叶片光合作用能力降低,最终严重影响植株生长发育。因此,在杂交鹅掌楸的栽培管理中土壤水分含量不宜长期过高。

关键词：杂交鹅掌楸体胚再生植株淹水胁迫超微结构光合特性

脱落酸和玉米素结合使用对杂交鹅掌楸体胚分化及发育的影响

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林业科学 2019年第3期55卷 64-71页

作者：陈婷婷王鹏凯张稼霁施季森成铁龙陈金慧南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京210037 南京林业大学生物与环境学院南京210037

【目的】探讨了不同浓度脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)处理对杂交鹅掌楸体胚发生发育的效应,为杂交鹅掌楸大规模繁殖技术的建立提供理论依据。【方法】以15-5202基因型的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织为材料,比较在体胚分化阶段单独添加ABA以及同... 详细信息

【目的】探讨了不同浓度脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)处理对杂交鹅掌楸体胚发生发育的效应,为杂交鹅掌楸大规模繁殖技术的建立提供理论依据。【方法】以15-5202基因型的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织为材料,比较在体胚分化阶段单独添加ABA以及同时添加ABA和ZT对体胚分化的影响;通过体胚发生数量统计、体胚生长状况观察等筛选出诱导效率高、体胚发育正常的体胚分化培养基。【结果】1)在体胚分化培养基中添加ABA对体胚的分化及成熟具有促进作用,添加0.5～1.5 mg·L^(-1) ABA可加快体胚发育,且体胚形态正常;添加2.0～2.5 mg·L^(-1) ABA时,虽使体胚分化率明显提高,但畸形胚比例增加;低浓度ABA处理30天后转入光培养2周体胚即可成熟;而未添加ABA处理的体胚在同样条件下未完全发育成熟,体胚呈白色、子叶淡黄色。2)在体胚分化培养基中同时添加ABA及ZT能提高体胚分化率及促进体胚发育; 2.0 mg·L^(-1) ABA结合0.2～0.4 mg·L^(-1) ZT处理后光培养2周,体胚形态发育正常,子叶分化明显,胚根健壮,生长状况较佳;未经过ZT处理的体胚生长发育较慢; ZT浓度高于0.6 mg·L^(-1)时体胚生长发育受到抑制,不利于体胚分化及成熟。【结论】在杂交鹅掌楸体胚分化培养基中添加2.0 mg·L^(-1) ABA和0.2～0.4 mg·L^(-1) ZT能够进一步提高体胚发生效率,促进体胚正常发育。

关键词：杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生脱落酸玉米素

Type-A细胞分裂素响应调节因子基因家族研究进展

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园艺学报 2023年第9期50卷 1867-1888页

作者：陆静韦素云尹佟明陈赢男南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

Type-A response regulators(RR)是细胞分裂素信号转导的末端组分,仅具有REC接收域,不仅影响植物生长发育,还响应非生物胁迫。本文中详细梳理了近年来草本和木本植物type-A RR鉴定、进化关系、表达模式、功能特征等研究进展,总结了潜在... 详细信息

Type-A response regulators(RR)是细胞分裂素信号转导的末端组分,仅具有REC接收域,不仅影响植物生长发育,还响应非生物胁迫。本文中详细梳理了近年来草本和木本植物type-A RR鉴定、进化关系、表达模式、功能特征等研究进展,总结了潜在的调控网络,以期为深入理解type-A RR负调节细胞分裂素信号的机制提供参考。

关键词：细胞分裂素 A型响应调节因子表达模式基因功能调控网络

杨属派间5个种特异性InDel引物及在派间杂交子代鉴别中的应用

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林业科学 2024年第2期60卷 78-86页

作者：戴晓港韩峭子尹佟明林木遗传育种全国重点实验室、南方现代林业协同创新中心、林木遗传与生物技术教育部重点实验室、江苏省林木遗传和高效培育重点实验室、南京林业大学林学院南京210037

【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小... 详细信息

【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小叶杨中种特异性InDel位点设计引物,并利用SeqHunter2依次比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,再用杨属5个派的自然群体材料进行种内保守及种间多态引物的试验验证,筛选出杨属不同派的特异性引物序列,对杨属不同派间杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将从美洲黑杨基因组设计的5000对InDel引物依次分别比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,最后筛选出341对引物在上述5个种中是通用的。从不同染色体上共选取48对引物并合成,利用5个树种各1个DNA检测得到43对引物是通用的,其中19对引物在不同种中扩增条带单一且存在差异。利用自然群体混合DNA对试验验证的19对通用引物进行种间多态性和种内保守性检测,初步获得4对多态性引物。最后再用自然群体DNA对这4对引物进行扩增检测,发现引物Chr12_4341229和Chr13_10582756在美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨中均只能扩增出一个位点,引物Chr12_4341229扩增条带分别为148、152、113、152和159 bp,引物Chr13_10582756扩增条带分别为140、144、116、140和159 bp。利用上述2对引物对小胡杨2号、黑胡杨和黑小杨进行鉴定,发现所有杂交子代个体均能检测它们2个亲本的特征带。引物Chr12_4341229和Chr13_10582756一起使用,可以用于美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨任意组合杂交子代的真实性鉴别。【结论】本研究获得了杨属5个派间的5个种的特异性InDel引物2对,可以有效地进行杨属不同派5个种之间任意组合种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步开展杨树派间杂交创制新种质提供了技术支持。

关键词：杨属远缘杂交物种特异性引物种间杂交分子鉴别

簸箕柳×三蕊柳种特异性KASP标记开发及种间杂交子代鉴别

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林业科学 2024年第4期60卷 119-126页

作者：戴晓港魏铭辰林木遗传育种全国重点实验室、南方现代林业协同创新中心、林木遗传与生物技术教育部重点实验室、江苏省林木遗传和高效培育重点实验室、南京林业大学林学院南京210037

【目的】开发簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,为开展簸箕柳和三蕊柳杂交选育速生、抗虫新种质的真实性鉴定提供参考。【方法】利用簸箕柳和三蕊柳重测序数据,开展全基因组SNP位点分析,筛选出种特异性的SNP位点并设计KASP引物,利用SeqHu... 详细信息

【目的】开发簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,为开展簸箕柳和三蕊柳杂交选育速生、抗虫新种质的真实性鉴定提供参考。【方法】利用簸箕柳和三蕊柳重测序数据,开展全基因组SNP位点分析,筛选出种特异性的SNP位点并设计KASP引物,利用SeqHunter2检测设计引物在簸箕柳中的通用性,并利用簸箕柳和三蕊柳自然群体材料对合成的引物进行实验验证,筛选出簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,并对它们的杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将三蕊柳和簸箕柳重测序的数据比对到三蕊柳基因组,共获得个6598144个SNPs。经过筛选,最终在簸箕柳中检测到674144个和三蕊柳相比为纯合突变的位点。从每条染色体上随机选取100个位点用于KASP引物设计,在1900个SNPs位点中,750个SNP位点可以成功设计出KASP引物。从每条染色体上选取2组,共选取38组引物,通过SeqHunter2检测得到11组引物在簸箕柳中是通用的。利用簸箕柳和三蕊柳自然群体DNA对合成的10组通用引物进行种内保守和种间差异性检测,获得4组在簸箕柳、三蕊柳和种间杂交子代中聚类明显的引物。引物Stri08_82809、Stri14_11602、Stri14_12274和Stri17_10731在簸箕柳自然群体中分别扩增出纯合G/G、T/T、A/A和T/T位点,在三蕊柳自然群体分别扩增出纯合A/A、C/C、G/G和C/C位点,而在真实杂交子代中分别扩增出G/A、T/C、A/G和T/C杂合位点。利用上述4组引物对簸箕柳×三蕊柳的杂交子代进行鉴定,发现在31个杂交子代中,29个个体扩增出杂合位点,说明同时遗传了2个亲本的特征位点,为真实的种间杂交子代。有2个个体扩增的位点为纯合且和母本相同,说明这2个子代为簸箕柳花粉污染的子代。【结论】本研究获得了簸箕柳和三蕊柳种间特异性KASP标记4组,可以准确快速的开展簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步簸箕柳和三蕊柳种间杂交及回交创制抗虫新品种提供了技术支持。

关键词：簸箕柳三蕊柳种间杂交物种特异性KASP引物种间杂交分子鉴别

CRISPR/Cas9系统在林木基因编辑中的应用

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遗传 2020年第7期42卷 657-668页

作者：陈赢男陆静南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京210037 南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心南京210037

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行精确定点编辑,是目前公认的最有发展潜力的基因编辑技术,并已在主要粮食及经济作物的精准育种方面发挥了重要作用。CRISPR/Cas9系统的出现也为林木基础研究和分子育种带来了新的途径。近年来CRISPR/C... 详细信息

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行精确定点编辑,是目前公认的最有发展潜力的基因编辑技术,并已在主要粮食及经济作物的精准育种方面发挥了重要作用。CRISPR/Cas9系统的出现也为林木基础研究和分子育种带来了新的途径。近年来CRISPR/Cas9系统在林木遗传研究中的应用越来越广泛,不仅实现了抗旱、抗病等林木新品种的培育,而且在调控木质素合成和缩短林木育种周期等方面也展现了巨大潜力。本文详细梳理了CRISPR/Cas9系统在林木基因功能验证及遗传改良中的研究进展,并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了展望,以期为林木功能基因组研究和林木基因工程育种提供有益参考。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑林木基因功能遗传改良

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南京地区簸箕柳雌、雄花序建成动态观察

南京林业大学学报（自然科学版） 2023年第1期47卷 154-162页

作者：向丽尹佟明陈赢男南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室南京林业大学林学院南方现代林业协同创新中心江苏南京210037

【目的】柳树雌株性成熟后会产生严重的飞絮污染,阐明其性别分化的分子机制是控制飞絮污染的关键。研究柳树雌、雄花芽分化以及花序建成的关键时期,为性别分化分子调控机理研究奠定基础。【方法】以木本植物簸箕柳(Salix suchowensis)... 详细信息

【目的】柳树雌株性成熟后会产生严重的飞絮污染,阐明其性别分化的分子机制是控制飞絮污染的关键。研究柳树雌、雄花芽分化以及花序建成的关键时期,为性别分化分子调控机理研究奠定基础。【方法】以木本植物簸箕柳(Salix suchowensis)雌株和雄株花芽及花序为材料,从当年6月至翌年2月分别在17个时间点采集样品,利用石蜡切片技术对其雌、雄花芽分化及花序建成过程进行观察,分析不同发育阶段的相关特征。【结果】簸箕柳花序建成初期为6月中旬至7月初,小花原基分化期在7月中旬至8月下旬,雌、雄蕊分化期在9月上旬至11月初,11月中旬至翌年2月初雌雄花序进入休眠期,翌年2月中旬至3月为大小孢子发生及雌雄配子体发育期,随后雌雄花序开放。研究表明,花序外观形态变化与内部解剖结构变化之间具有一定的相关性。【结论】簸箕柳雌、雄花均为单性花。花序生长趋势总体呈“S”形上升趋势,在整个发育过程中,雄花序比雌花序外形稍大。簸箕柳花序外观形态可以用于判断花发育的关键时期。研究结果为全面了解簸箕柳花芽分化以及花序建成的完整过程提供了详细信息,为进一步阐明不同关键发育阶段的分子调控机制奠定了基础。

关键词：簸箕柳花芽分化花序建成外部形态解剖结构

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