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可视化蛋白芯片检测牛奶中庆大霉素的方法研究

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分析科学学报 2014年第5期30卷 687-691页

作者：李周敏许丹科南京大学金陵学院化学与生命科学学院江苏南京210089 生命分析化学国家重点实验室南京大学化学化工学院江苏南京210093

本文采用间接竞争免疫法,研究了可视化蛋白芯片快速检测牛奶中庆大霉素的方法。在固定有庆大霉素人工抗原的醛基修饰芯片的反应区内,加入庆大霉素单克隆抗体和游离的庆大霉素或牛奶样品混合物,待抗原抗体反应完全后依次加入纳米银标记... 详细信息

本文采用间接竞争免疫法,研究了可视化蛋白芯片快速检测牛奶中庆大霉素的方法。在固定有庆大霉素人工抗原的醛基修饰芯片的反应区内,加入庆大霉素单克隆抗体和游离的庆大霉素或牛奶样品混合物,待抗原抗体反应完全后依次加入纳米银标记的二抗（羊抗鼠）及银增强显色剂进行可视化检测,结果采用可视化生物芯片检测系统进行定量分析。通过设计制备内标点及建立的内标曲线,可在同一孔内定量检测游离的庆大霉素。该法庆大霉素的线性检测范围为0.1∽200ng/mL,检测限为0.1ng/mL,样品的加标回收率为95%∽112%。

关键词：蛋白芯片可视化检测庆大霉素牛奶

RNA结合蛋白的CLIP-seq数据的生物信息学分析流程建立及初步应用

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中国科学：生命科学 2021年第4期51卷 450-461页

作者：谢正尧臧敏李鑫徐宇君南京医科大学生殖医学国家重点实验室南京211166

近年来,紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(UV cross-linking immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing, CLIP-seq)成为鉴定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)的靶标序列和结合位点的新技术,为研究RNA结合蛋白功能、解析其分子机制提供了强有力的工具.尽管国际上已有应用CLIP技术的报道,但是实验方法周期长、技术性强,尤其是后续的数据处理和生物信息学分析令没有计算机基础和专职生物信息分析人员的实验室望而却步.基于2016年Van Nostrand等人优化的CLIP方法,本团队建立并完成了多个RBP在组织和细胞中的CLIP测序及数据的生物信息学分析流程,并验证了其可行性.本研究整合了多家实验室已公开发表的分析软件和脚本,对人前列腺癌DU145细胞系中的PUMILIO1(PUM1)蛋白CLIP-seq数据进行分析,总结出对于蛋白功能分析更有效的命令和参数,并建立了完整的生物信息学分析流程.运用该流程寻找PUM1蛋白在人前列腺癌发展中的潜在机制,本团队识别出PUM1在DU145细胞系中的1189个靶标,并发现PUM1主要结合其靶标mRNA的3′非翻译区(untranslated region, UTR)和转录终止位点(transcription termination sites, TTS)区域, UGUAHAUA(H代表A/U/C)基序(motif)为PUM1蛋白识别的特征性序列. PUM1可能通过结合靶标mRNA的3′UTR对靶标进行转录后调控,参与癌细胞的生长、分化等过程以及相关的癌症通路中.本团队还发现, PUM1在人前列腺癌细胞系中能够与其他物种或组织中类似的靶标结合,并且结合方式高度一致,这与该家族蛋白在RNA结合功能域和功能上的高度保守性相符合.因此,本文报道的技术方法和生物信息学分析流程可以为有兴趣开展RBP的靶标鉴定的研究人员提供一个一站式的方法学服务平台,也有助于推动转录后调控在疾病和发育中的机制研究和RBP的RNA调控等新兴领域的发展.

关键词： RNA结合蛋白紫外交联免疫沉淀高通量测序生物信息学 PUM1 前列腺癌 3′UTR

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结肠炎癌转化调控机制和化学干预的研究进展

药学学报 2022年第5期57卷 1273-1281页

作者：刘怡彤孙洋南京大学生命科学学院生物技术与药学系医药生物技术国家重点实验室江苏南京210023

结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤,炎症性肠病发展为结直肠癌的风险显著增加。免疫信号通路NF-κB、IL-6/STAT3、COX-2/PGE2、IL-23/Th17、TLRs等已被证实能够促进结肠炎向结直肠癌转化的进程,NOD2与肠道微生物的作用也参与炎癌转化的调控... 详细信息

结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤,炎症性肠病发展为结直肠癌的风险显著增加。免疫信号通路NF-κB、IL-6/STAT3、COX-2/PGE2、IL-23/Th17、TLRs等已被证实能够促进结肠炎向结直肠癌转化的进程,NOD2与肠道微生物的作用也参与炎癌转化的调控。慢性炎症作为结直肠癌的潜在风险,抑制炎症的药物可能起到化学预防的作用。本综述对结肠炎癌转化过程相关的信号通路进行了总结,并对用于结肠癌化学预防的药物进行了概述。

关键词：炎症性肠病结直肠癌炎症信号通路炎癌转化化学预防

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前列腺癌干细胞的研究方法

中华腔镜泌尿外科杂志（电子版） 2015年第3期9卷 1-4页

作者：成向明甘卫东李冬梅南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科南京210008 南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室南京大学江苏省医学分子技术重点实验室南京大学生命分析化学国家重点实验室南京210093

前列腺癌是危及全世界男性健康的疾病,尤其是在西方国家,据估计美国2013年约有238 590例新发病例及29 720例癌相关死亡病例[1]。尽管亚洲人群的前列腺癌发病率及死亡率较低,但近20年来该比率迅速上升[2]。早期局限性肿瘤可以通过外科手... 详细信息

前列腺癌是危及全世界男性健康的疾病,尤其是在西方国家,据估计美国2013年约有238 590例新发病例及29 720例癌相关死亡病例[1]。尽管亚洲人群的前列腺癌发病率及死亡率较低,但近20年来该比率迅速上升[2]。早期局限性肿瘤可以通过外科手术、激素治疗及放射治疗获得治愈,但对于晚期肿瘤而言,激素去势治疗仅在治疗早期有效,最终将形成去势抵抗。

关键词：去势治疗晚期肿瘤外科手术亚洲人群细胞亚群放射治疗雌激素受体人前列腺前列腺上皮细胞西方国家

Hsp60C是果蝇精子分化与成熟所必需的线粒体分子伴侣蛋白

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中国科学：生命科学 2023年第1期53卷 82-93页

作者：肖天衡程丽萍徐宇君南京医科大学生殖医学国家重点实验室南京211166

HSP60家族是从原核生物到真核生物均保守的分子伴侣蛋白家族,在蛋白稳态与细胞应激中发挥重要功能. HSP60在生物生殖发育中起着重要的作用,但在果蝇生殖发育过程中的调控机制与表达定位尚不明确.本研究通过RT-qPCR, Western blot和免疫... 详细信息

HSP60家族是从原核生物到真核生物均保守的分子伴侣蛋白家族,在蛋白稳态与细胞应激中发挥重要功能. HSP60在生物生殖发育中起着重要的作用,但在果蝇生殖发育过程中的调控机制与表达定位尚不明确.本研究通过RT-qPCR, Western blot和免疫荧光染色技术,发现果蝇Hsp60C为睾丸特异性表达,定位于各级生精细胞的线粒体衍生聚合体(Nebenkern)中.敲除hsp60C后,果蝇呈现出雄性不育,但在精子发生早期的减数分裂和精子变形均为正常,果蝇的存活及雌蝇育性也显示正常;hsp60C敲除果蝇的精子发生个体化阶段存在缺陷以致无法产生成熟精子,但睾丸过表达Hsp60C可以挽救敲除雄蝇的育性.深入研究不育果蝇的精子发生缺陷,发现hsp60C敲除的精子个体化阶段后线粒体存在形态结构异常.与w1118野生型对照相比, hsp60C敲除后睾丸中线粒体能量代谢相关基因转录本水平发生改变,并且伴有AMPK通路和JNK通路的激活.综上所示, Hsp60C作为线粒体分子伴侣蛋白在精子发生过程中起着重要作用.

关键词： Hsp60C 精子发生线粒体精子个体化分子伴侣 Nebenkern 蛋白稳态

转录因子OCT-4对靶基因AP-2γ表达调控的研究

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生物化学与生物物理进展 2013年第1期40卷 43-49页

作者：赵晓蒙王成李晓峰张晓婷刘喜枝周畅湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室长沙410081

OCT-4和AP-2γ是近年来睾丸生殖细胞瘤诊断过程中研究的热点基因.作为一个在胚胎发育中起着重要作用的转录因子,OCT-4基因在发育的不同时期、不同分化过程中发挥着多种生物学功能,其作用是通过对靶基因的调控来实现的.本研究运用多种软... 详细信息

OCT-4和AP-2γ是近年来睾丸生殖细胞瘤诊断过程中研究的热点基因.作为一个在胚胎发育中起着重要作用的转录因子,OCT-4基因在发育的不同时期、不同分化过程中发挥着多种生物学功能,其作用是通过对靶基因的调控来实现的.本研究运用多种软件分析,发现AP-2γ启动子区域的序列部分有OCT-4的结合位点.利用CHIP-PCR方法鉴定AP-2γ是OCT-4调控的靶基因.应用Luciferase assay、免疫荧光实验、小鼠隐睾模型等实验进行验证,OCT-4基因抑制AP-2γ转录活性和影响其蛋白质水平的表达.这一新发现,有利于从分子水平上研究睾丸生殖细胞瘤的发生机制.

关键词：睾丸生殖细胞肿瘤 OCT-4 靶基因 AP-2γ

气道喷雾博来霉素建立特发性肺纤维化模型的研究

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实用老年医学 2013年第9期27卷 751-755页

作者：王聪朱绘明钱卫平韩晓冬南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室江苏省医学分子技术重点实验室生命分析化学国家重点实验室江苏省南京市210093 东南大学生物电子学国家重点实验室江苏省南京市210096

目的评估气道喷雾博来霉素建立的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)模型相关纤维化指标的变化。方法首先通过观察经气道给予Sprague-Dawley(SD)大鼠肺组织中伊文斯兰染液的分布,比较气道滴入与气道喷雾给药两种方法药... 详细信息

目的评估气道喷雾博来霉素建立的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)模型相关纤维化指标的变化。方法首先通过观察经气道给予Sprague-Dawley(SD)大鼠肺组织中伊文斯兰染液的分布,比较气道滴入与气道喷雾给药两种方法药物在肺组织中的分布;继而通过气道喷雾给药的方法 ,按5 mg/kg的剂量经气道给予实验组大鼠博来霉素,以建立IPF大鼠模型;对照组给予生理盐水。观察给药后7 d、14 d、21 d及28 d后肺组织苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)及Masson染色、肺组织羟脯氨酸含量、血气分析等结果评估是否造模成功。通过Western blot检测肺组织中E-钙黏素、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等蛋白标记评估肺组织纤维化程度。结果气道喷雾给药后,伊文斯兰染液在肺组织中的分布更为均匀;给药后各时间点结果显示,相较于对照组,实验组大鼠HE及Masson染色提示肺组织中成纤维细胞及胶原含量逐步增多,肺组织羟脯氨酸含量明显升高(P<0.05);除28 d组外,其余各组动脉血氧分压较对照组显著下降(P<0.05)。Western blot结果提示造模成功的IPF大鼠模型肺组织E-钙黏素表达降低,而波形蛋白、α-SMA表达增多。结论气道喷雾给予博来霉素可成功建立IPF大鼠模型,且纤维化病灶均一。

关键词：博来霉素特发性肺纤维化动物模型气管内雾化

高效检测人降钙素原化学发光免疫分析方法的建立与评价

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中国病原生物学杂志 2017年第4期12卷 306-310,316页

作者：羊婷婷余易展刘培王念超卢彦黄亚红南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室江苏南京210000

目的重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法。方法根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切将其构建到pET32a载体上;... 详细信息

目的重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法。方法根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切将其构建到pET32a载体上;将pET32a-PCT质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用Western blot法分析重组蛋白表达情况;用镍亲和纯化柱纯化重组蛋白,以此为抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化后再用间接ELISA法筛选阳性单克隆细胞;将阳性单克隆细胞接种于小鼠腹腔内,制备腹水单抗,经Protein A/G纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,采用间接ELISA方法对抗体的特异性、灵敏度以及亲和力进行鉴定;用NaIO4氧化HRP法标记单克隆抗体,通过棋盘法筛选配对单克隆抗体,以筛选的配对抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心化学发光免疫分析的血清学检测体系,检测临床150例血清标本,其中PCT升高(>0.05ng/ml)120例,PCT阴性(化学发光免疫分析方法检测线性范围为0.06~8ng/ml,其中阳性检出率为96.6%,阴性符合率为100%,与临床检测数据相比,相关系数R^2=0.9737。结论建立的双抗夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠,可用于细菌、寄生虫等病原体感染患者的PCT血清学定量检测。

关键词：单克隆抗体人降钙素原(PCT) 双抗体夹心定量检测

金属介导的免疫调控与干预:金属免疫学的兴起与展望

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中国科学：化学 2019年第8期49卷 1037-1046页

作者：李劼郑鹏赵劲陈鹏郭子建南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室南京210023 北京大学化学与分子工程学院北京分子科学国家研究中心北京100871

金属元素是生命体的重要组成部分,金属离子及金属蛋白在包括物质存储运输、能量转化传递、信号转导调控、分子合成降解等在内的几乎所有生命过程中都发挥着重要作用.金属在免疫系统,尤其是免疫应答的调控过程中也扮演关键角色,其调控的... 详细信息

金属元素是生命体的重要组成部分,金属离子及金属蛋白在包括物质存储运输、能量转化传递、信号转导调控、分子合成降解等在内的几乎所有生命过程中都发挥着重要作用.金属在免疫系统,尤其是免疫应答的调控过程中也扮演关键角色,其调控的异常往往导致疾病的发生.近年来,免疫相关的肿瘤治疗方案让人们看到了治愈癌症的希望.金属元素在免疫应答和肿瘤治疗中的重要作用正逐渐受到关注,是未来发展的重要方向;然而,目前大多数研究仅仅停留在现象描述阶段,难以在分子层面阐明机制.本文简要介绍了金属元素在免疫应答过程中的关键作用以及在癌症免疫治疗中的重要应用,阐述了"金属免疫学"(Metalloimmunology)这一正在兴起的前沿交叉领域的研究范畴、科学价值和发展趋势.

关键词：金属免疫学金属离子金属药物肿瘤免疫宿主-病原菌相互作用