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TBKI对NLRC4炎症小体的作用及其机制研究

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南京医科大学学报(自然科学版) 2024年

作者：曾强张在奎孙乃双陈允梓南京医科大学基础医学院免疫学系

目的：探究TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)调控核苷结合寡聚化结构域样受体4(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 4,NLRC4)炎症小体激活的作用及其机制。方法：在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.T）感染的永生化骨髓巨噬细胞（immortalized bone marrow derived macrophage,IBMDM）中，Western blot检测NLRC4炎症小体激活及其下游分子半胱天冬蛋白酶1(cysteine aspartic acid specific protease 1,Caspase-1)和Gasdermin D(GSDMD)的剪切情况；乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞培养基上清中乳酸脱氢酶的含量；蛋白质免疫共沉淀实验确定TBK1与NLRC4的相互作用及其具体结构域；细胞免疫荧光实验确定TBK1与NLRC4的空间定位；GST pull-down实验确定TBK1与NLRC4是否存在直接相互作用；凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）寡聚化检测实验验证NLRC4炎症小体组装。构建S.T感染C57BL/6小鼠动物模型，观察小鼠生存情况。涂板计数腹腔灌洗液和肺的细菌负荷量；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测腹腔灌洗液及血清中的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α和白细胞介素（interleukin,IL）-1β的含量；流式细胞术检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结果：在S.T感染的IBMDM中，抑制TBK1可减弱NLRC4炎症小体激活，NLRC4磷酸化水平下降，Caspase-1与GSDMD的剪切减少；TBK1与NLRC4存在相互作用，TBK1的N端与NLRC4的NACHT结构域相互作用；TBK1与NLRC4存在空间上的共定位；TBK1可以磷酸化NLRC4的Ser533位点。S.T动物模型实验显示，抑制TBK1活性可以显著提高小鼠的生存率；减低小鼠腹腔灌洗液和肺中的细菌负荷量；降低血清以及腹腔灌洗液中的IL-1β、TNF-α的表达水平；减少腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结论：TBK1与NLRC4相互作用，磷酸化NLRC4 Ser533位点，促进NLRC4炎症小体的激活，为治疗相关疾病提供理论依据和新的潜在靶点。

关键词： NLRC4炎症小体 TBK1 鼠伤寒沙门氏菌

IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路增强小鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能

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细胞与分子免疫学杂志 2024年第1期40卷 13-18页

作者：华梦晴高培宇方芳苏浩宇宋传旺蚌埠医学院检验医学院免疫学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室安徽蚌埠233030

目的探讨白细胞介素6(IL-6)对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响及其相关机制。方法脂多糖(LPS)经气道滴入激发构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6的含量。体外培养MH-S细胞,在信号转导子与转录激... 详细信息

目的探讨白细胞介素6(IL-6)对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响及其相关机制。方法脂多糖(LPS)经气道滴入激发构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6的含量。体外培养MH-S细胞,在信号转导子与转录激活子3 (STAT3)抑制剂Stattic(5μmol/L)存在与否的情况下,再加入IL-6(10 ng/mL~500 ng/mL)刺激6 h,加入荧光微球孵育2 h后,采用流式细胞术检测MH-S细胞吞噬荧光微球情况;Western blot法检测磷酸化的Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)、纤维型肌动蛋白(F-actin)的表达水平。结果鼻腔滴入LPS后,小鼠BALF中IL-6含量显著升高。随着IL-6刺激剂量的增加,MH-S细胞吞噬荧光微球的作用增强,Arp2、 F-actin蛋白的表达水平升高。100 ng/mL IL-6刺激MH-S细胞后,p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平升高。阻断MH-S细胞STAT3信号后,IL-6促进细胞吞噬的效应完全消失,IL-6诱导的Arp2、 F-actin蛋白表达增加被抑制。结论 IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路促进MH-S细胞Arp2、 F-actin蛋白的表达增强吞噬功能。

关键词：白细胞介素6(IL-6) MH-S细胞吞噬功能 Janus激酶2(JAK2) 信号转导子与转录激活子3(STAT3) 肺泡巨噬细胞

TBK1对NLRC4炎症小体的作用及其机制研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2024年第5期44卷 595-603,614页

作者：曾强张在奎孙乃双陈允梓南京医科大学基础医学院免疫学系江苏南京211166

目的:探究TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)调控核苷结合寡聚化结构域样受体4(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 4,NLRC4)炎症小体激活的作用及其机制。方法:在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.T)感染的永生化骨髓巨噬细胞(immortalized bone marrow derived macrophage,IBMDM)中,Western blot检测NLRC4炎症小体激活及其下游分子半胱天冬蛋白酶1(cysteine aspartic acid specific protease 1,Caspase-1)和Gasdermin D(GSDMD)的剪切情况;乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞培养基上清中乳酸脱氢酶的含量;蛋白质免疫共沉淀实验确定TBK1与NLRC4的相互作用及其具体结构域;细胞免疫荧光实验确定TBK1与NLRC4的空间定位;GST pull-down实验确定TBK1与NLRC4是否存在直接相互作用;凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)寡聚化检测实验验证NLRC4炎症小体组装。构建S.T感染C57BL/6小鼠动物模型,观察小鼠生存情况。涂板计数腹腔灌洗液和肺的细菌负荷量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹腔灌洗液及血清中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白细胞介素(interleukin,IL)-1β的含量;流式细胞术检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结果:在S.T感染的IBMDM中,抑制TBK1可减弱NLRC4炎症小体激活,NLRC4磷酸化水平下降,Caspase-1与GSDMD的剪切减少;TBK1与NLRC4存在相互作用,TBK1的N端与NLRC4的NACHT结构域相互作用;TBK1与NLRC4存在空间上的共定位;TBK1可以磷酸化NLRC4的Ser533位点。S.T动物模型实验显示,抑制TBK1活性可以显著提高小鼠的生存率;减低小鼠腹腔灌洗液和肺中的细菌负荷量;降低血清以及腹腔灌洗液中的IL-1β、TNF-α的表达水平;减少腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。结论:TBK1与NLRC4相互作用,磷酸化NLRC4 Ser533位点,促进NLRC4炎症小体的激活,为治疗相关疾病提供理论依据和新的潜在靶点。

关键词： NLRC4炎症小体 TBK1 鼠伤寒沙门氏菌

研究生免疫学思政教学案例库建设的探索与实践

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细胞与分子免疫学杂志 2024年

作者：方亮陈丽华空军军医大学基础医学院免疫学教研室

免疫学是生物学和医学领域的支柱性学科，对于生物学、医学、药学、生物技术等相关领域的研究生来说，免疫学也是一门专业必修课程。随着新时代党和国家对高等教育提出的新要求，课程思政成为加强高校人才培养和思想政治教育的新举措和... 详细信息

免疫学是生物学和医学领域的支柱性学科，对于生物学、医学、药学、生物技术等相关领域的研究生来说，免疫学也是一门专业必修课程。随着新时代党和国家对高等教育提出的新要求，课程思政成为加强高校人才培养和思想政治教育的新举措和新方向。近年来我校研究生免疫学教学在思政改革方面取得了一定的进展和成绩，完成了思政教学案例库的建设。在建设过程中，我们以学科专业知识为主线，通过将思政内容系统化和分类化，创新性的凝练出包含多个类别的思政案例库。通过对案例库的使用，我们在研究生免疫学教学中有效解决了专业知识和思想政治教育较难融合这一关键问题，为教师提供有力的支持，同时提升了专业课程的教学效果，协助达成“立德树人，为战育人”的教学目标。

关键词：免疫学思政教学案例库

白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病

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中国组织工程研究 2025年第23期29卷 4878-4887页

作者：冯乙芮高天芸王亚萍黄亚红王斌南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室南京大学生命科学学院江苏省南京市210008 南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室江苏省南京市210008 临床干细胞研究室南京鼓楼医院南京中医药大学鼓楼临床医学院江苏省南京市210008 南京大学生命科学学院江苏省南京市210008

背景:间充质干细胞来源广泛、易体外增殖,并可分泌一系列免疫调节因子抑制炎症、促进组织修复再生,广泛应用于各种疾病治疗研究。但是对于多种疾病,间充质干细胞的治疗效果有限。针对疾病特定发病机制或者干预靶点进行工程化修饰间充质... 详细信息

背景:间充质干细胞来源广泛、易体外增殖,并可分泌一系列免疫调节因子抑制炎症、促进组织修复再生,广泛应用于各种疾病治疗研究。但是对于多种疾病,间充质干细胞的治疗效果有限。针对疾病特定发病机制或者干预靶点进行工程化修饰间充质干细胞是未来细胞治疗的重要发展方向。目的:白细胞介素10是一种典型的抗炎细胞因子,有助于调节免疫反应并诱导巨噬细胞向抗炎表型极化,该研究探讨白细胞介素10基因工程化修饰人脐带间充质干细胞对炎症性肠病的治疗效果。方法:通过电转染建立稳定过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞,并基于细胞治疗产品标准筛选出临床级细胞。给予C57BL/6J小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液建立急性结肠炎模型,分别在造模前1 d(尾静脉途径)与造模后第4天(腹腔途径)注射空质粒转染的人脐带间充质干细胞或过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞(1×10~6个/只)。在造模后第6天取结肠组织进行苏木精-伊红染色评估组织学变化,免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原与CD31的表达。结果与结论:构建的稳定过表达白细胞介素10的工程化人脐带间充质干细胞,满足临床级人脐带间充质干细胞质量标准;人脐带间充质干细胞对小鼠急性结肠炎具有修复效果,过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞的治疗效果更加优效,更显著地抑制急性结肠炎小鼠的体质量下降(P<0.05)、结肠缩短(P<0.05)以及结肠组织损伤(P<0.05);过表达白细胞介素10基因人脐带间充质干细胞组结肠组织切片中增殖细胞核抗原阳性细胞与CD31阳性细胞显著多于人脐带间充质干细胞组,表明过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞可能通过显著促进肠组织细胞增殖和血管再生进而促进结肠组织修复。

关键词：白细胞介素10 人脐带间充质干细胞工程化修饰间充质干细胞炎症性肠病再生修复细胞增殖肠再生

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外泌体来源microRNA在微生物感染中的作用研究进展

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中国病原生物学杂志 2024年第6期19卷 729-732页

作者：杜文雅马枫茜代禹美陈瑞枫王国富吴利先大理大学基础医学院微生物学与免疫学教研室云南大理671000

外泌体包含母细胞来源的蛋白质、脂质和核酸等多种成分,其中核酸中的miRNA起到越来越重要的作用,miRNA通过靶向mRNA 3′端非翻译区结合导致mRNA降解或翻译抑制。许多疾病的发生都伴随着miRNA表达失调,这对宿主基因调控和某些分子机制产... 详细信息

外泌体包含母细胞来源的蛋白质、脂质和核酸等多种成分,其中核酸中的miRNA起到越来越重要的作用,miRNA通过靶向mRNA 3′端非翻译区结合导致mRNA降解或翻译抑制。许多疾病的发生都伴随着miRNA表达失调,这对宿主基因调控和某些分子机制产生影响。越来越多研究证明miRNA可以作为疾病的潜在生物标志物、治疗靶点,参与炎症反应的过程等。本文就外泌体中的miRNA在病毒,细菌等微生物导致的感染性疾病,如流感病毒、肝炎病毒、HIV、结核分枝杆菌、梅毒螺旋体和支原体中的作用进行综述。

关键词：外泌体 miRNA 微生物感染性疾病综述

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结直肠癌中自然杀伤细胞表型及功能初探

上海交通大学学报（医学版） 2024年第6期44卷 713-722页

作者：冯昫皎刘健悦戚炀炀孙晶沈蕾上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海市免疫学研究所上海200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科上海市微创外科临床医学中心上海200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院免疫与疾病研究中心上海200025

目的·初步探究结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者肿瘤组织中免疫微环境的组成,分析自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)在CRC中的比例、表型及功能特征。方法·收集CRC患者肿瘤组织及配对的癌旁组织和匹配的CRC患者外周血样本... 详细信息

目的·初步探究结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者肿瘤组织中免疫微环境的组成,分析自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)在CRC中的比例、表型及功能特征。方法·收集CRC患者肿瘤组织及配对的癌旁组织和匹配的CRC患者外周血样本,消化组织制备成单细胞悬液,使用流式细胞术检测各类免疫细胞比例,通过t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding)降维与统计学分析,描述CRC肿瘤免疫微环境的特征。运用流式细胞术检测肿瘤组织和癌旁组织中NK细胞表面活化分子的表达情况,包括CD16、CD27、CD69、晚期活化标志人类白细胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR,HLA-DR)、细胞耗竭标志T细胞免疫球蛋白与黏蛋白结构域3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,TIM-3)。运用流式细胞术探究CD38分子在NK细胞上的表达水平,描述CD38highNK细胞的表型特征。利用细胞刺激试剂盒激活NK细胞,通过流式细胞术胞内染色检测NK细胞的功能,包括细胞因子γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的表达水平。结果·收集25例CRC患者肿瘤组织及配对的癌旁组织和15例匹配的CRC患者外周血样本。CRC肿瘤组织中包含T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞及髓系细胞等免疫细胞。与癌旁组织相比,肿瘤组织中T淋巴细胞(P=0.000)和髓系细胞(P=0.026)的比例显著升高,NK细胞(P=0.007)的比例显著降低,B淋巴细胞比例差异无统计学意义。与癌旁组织相比,肿瘤组织中NK细胞表面CD27(P=0.000)、CD69(P=0.001)表达水平显著降低,同时CD16(P=0.008)、HLA-DR(P=0.000)和TIM-3(P=0.024)的表达水平显著升高,呈现晚期活化和耗竭表型。NK细胞按CD38的表达水平可分为CD38highNK和CD38lowNK 2个亚群。与癌旁组织相比,肿瘤组织CD38highNK(P=0.003)比例显著降低,CD38lowNK比例差异无统计学意义。相比CD38lowNK,CD38highNK的CD27高表达,CD16、NKp46、CD57、CD94、HLA-DR和CD158a低表达(均P=0.000),处于早期分化和未活化的状态。肿瘤浸润的NK细胞与癌旁组织相比,分泌细胞因子IFN-γ(P=0.032)、TNF-α(P=0.042)和GM-CSF(P=0.019)的水平显著降低,表明NK细胞杀伤功能受损。结论·CRC患者肿瘤组织中NK细胞浸润减少,早期分化状态的CD38highNK细胞亚群下降,分泌细胞因子的能力下降并呈现耗竭表型。这些结果提示NK细胞在CRC中功能受损,介导的抗肿瘤免疫应答下降。

关键词：自然杀伤细胞结直肠癌 CD38

青藤碱抑制PDGF/PDGFR信号通路在NETs诱导RA-FLS迁移作用中的机制研究

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中国中药杂志 2024年第7期49卷 1947-1955页

作者：张永强丁从珠孙玥南京中医药大学鼓楼临床医学院风湿免疫科江苏南京210008

探究青藤碱抑制血小板衍生生长因子/血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor/platelet-derived growth factor receptor,PDGF/PDGFR)信号通路在中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)诱导类风湿关节炎-成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)迁移作用中的相关机制。从3例RA患者滑膜组织中分离培养RA-FLS;从4例RA患者和4名健康体检者(healthy control,HC)外周静脉血中提取NETs。RA-FLS分为对照组、HC-NETs组、RA-NETs组、RA-NETs+青藤碱组、RA-NETs+青藤碱+CP-673451组,通过RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析HC-NETs组、RA-NETs组细胞差异表达基因,使用在线工具Sangerbox数据库进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,使用AutoDock Vina、PyMOL软件对青藤碱与PDGFβ、PDGFRβ作用靶点进行分子对接。通过cell counting kit-8(CCK-8)、划痕实验检测各组RA-FLS增殖和迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PDGFRβ蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)相关基因表达。结果显示,RA患者中性粒细胞更易产生NETs。与HC-NETs组相比,RA-NETs组PDGFβ、PDGFRβ表达上调;与对照组相比,RA-NETs组细胞增殖能力,细胞迁移率,PDGFRβ蛋白,PDGFβ、PDGFRβ、MMP1、MMP3、MMP9 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与RA-NETs组相比,RA-NETs+青藤碱组细胞增殖能力、细胞迁移率、PDGFRβ蛋白与mRNA表达水平,及MMP1、MMP3、MMP9 mRNA表达水平均降低(P<0.05)。与RA-NETs+青藤碱组相比,RA-NETs+青藤碱+CP-673451组细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结果显示,青藤碱通过抑制PDGF/PDGFR信号通路降低RA-NETs诱导RA-FLS迁移能力,实现对RA的缓解效果。

关键词：类风湿关节炎青藤碱 PDGF/PDGFR信号通路中性粒细胞胞外诱捕网成纤维样滑膜细胞

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眼内液检测对急性视网膜坏死综合征继发视网膜脱离的预测作用

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中华眼底病杂志 2024年第7期40卷 512-517页

作者：赵玥汤凌云姚进蒋沁张明顺南京医科大学附属眼科医院南京210029 南京医科大学基础医学院免疫学系南京210029

目的探讨眼内液检测对急性视网膜坏死综合征(ARN)继发视网膜脱离(RD)的预测作用。方法回顾性临床研究。2019年1月至2023年10月于南京医科大学附属眼科医院检查确诊的ARN患者40例40只眼纳入研究。根据随访期间是否发生RD,将患者分为发生R... 详细信息

目的探讨眼内液检测对急性视网膜坏死综合征(ARN)继发视网膜脱离(RD)的预测作用。方法回顾性临床研究。2019年1月至2023年10月于南京医科大学附属眼科医院检查确诊的ARN患者40例40只眼纳入研究。根据随访期间是否发生RD,将患者分为发生RD组(A组)、未发生RD组(B组),分别为18例18只眼、22例22只眼。患者均在确诊后行玻璃体腔注射20 mg/ml更昔洛韦0.1 ml(含更昔洛韦2 mg)治疗,2~3次/周。首次玻璃体腔注射更昔洛韦前抽取前房水,检测其中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、血管细胞黏附因子(VCAM)、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10浓度;荧光定量聚合酶链反应检测其中单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)载量。受试者工作特征曲线(ROC曲线)计算并分析房水中炎性细胞因子以及HSV-DNA、VZV-DNA载量预测ARN患者发生RD的ROC曲线下面积(AUC),评判其预测价值。结果A组18只眼、B组22只眼中,感染VZV、HSV分别为16、2只眼和21、1只眼。两组患眼房水VZV-DNA、HSV-DNA载量比较,差异有统计学意义(Z=-3.762,P学意义(P学意义(Z=-0.054,P=0.957)。ROC曲线分析结果显示,VEGF、病毒载量、IL-10、IL-8、IL-6、BFGF预测ARN发生RD的AUC分别为0.871、0.848、0.828、0.823、0.806、0.737;VEGF、IL-10、IL-8、IL-6、BFGF联合预测ARN发生RD的AUC为0.924。最佳截断值:病毒载量为0.40×106拷贝/ml,IL-10、IL-8、IL-6分别为50.65、1695.50、6634.00 pg/ml。结论房水病毒载量以及细胞因子单独或联合对ARN发生RD具有较高的预测价值。

关键词：急性视网膜坏死综合征视网膜脱离房水病毒核酸细胞因子