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iPSCs遗传稳定性与重编程机制的研究进展

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遗传 2014年第9期36卷 879-887页

作者：任才芳孙红艳王立中张国敏樊懿萱颜光耀王丹王锋南京农业大学、江苏省家畜胚胎工程实验室南京210095

诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是采用特定转录因子,将体细胞重编程为具有多能性的干细胞。iPSCs已成功由多种体细胞诱导出来,不仅具有发育多能性还能避免胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)的伦理道德问... 详细信息

诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是采用特定转录因子,将体细胞重编程为具有多能性的干细胞。iPSCs已成功由多种体细胞诱导出来,不仅具有发育多能性还能避免胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)的伦理道德问题,已成为生命科学领域不可或缺的研究工具,具有广阔的应用前景。但获得高质量、遗传稳定的iPSCs是当前亟须解决的问题。文章对iPSCs重编程机制和遗传稳定性的研究进展进行了综述,以期为提高iPSCs的诱导效率、降低诱导成本、掌握iPSCs质量控制的关键点提供参考,从而推进多能性干细胞临床应用的发展。

关键词： iPSCs 遗传稳定性重编程机制表观遗传学

干扰EZH2的表达对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响

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南京农业大学学报 2021年第4期44卷 726-732页

作者：蔡玉邓明田刘孜斐张国敏马键宇安世钰王智博张艳丽王锋南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

[目的]本试验旨在探究EZH2对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响。[方法]通过siRNA干扰EZH2在奶山羊精原干细胞中的表达,验证干扰效率,并采用ELISA、qPCR和Western blot检测抗氧化酶活性和抗氧化相关基因与蛋白表达水平。[结果]与对照组... 详细信息

[目的]本试验旨在探究EZH2对奶山羊精原干细胞抗氧化能力的影响。[方法]通过siRNA干扰EZH2在奶山羊精原干细胞中的表达,验证干扰效率,并采用ELISA、qPCR和Western blot检测抗氧化酶活性和抗氧化相关基因与蛋白表达水平。[结果]与对照组相比,干扰EZH2极显著提高奶山羊精原干细胞中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性(P<0.01),而丙二醛(MDA)含量极显著下降(P<0.01)。在分子水平上,干扰EZH2后,奶山羊精原干细胞中CAT、SOD2蛋白和mRNA表达水平均极显著提高(P<0.01),GPx mRNA表达水平极显著上升(P<0.01)。[结论]在体外培养的奶山羊精原干细胞中,干扰EZH2增强了细胞的抗氧化能力,其分子机制可能与激活CAT和SOD2蛋白并促进其下游抗氧化基因GPx表达相关。

关键词：山羊睾丸精原干细胞 EZH2 抗氧化能力

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小梅山猪骨髓间充质干细胞Cx43基因修饰

生物工程学报 2015年第3期31卷 351-360页

作者：樊懿萱张艳丽王强任才芳王锋南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

通过在小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)中过表达缝隙连接蛋白43基因(Cx43),探究Cx43对小梅山猪BMSCs增殖及凋亡的影响,为构建转基因动物模型奠定基础。利用分子技术构建Cx43真核表达载体p EGFP-Cx43,Nucleofector TM法转染P3代BMSCs,... 详细信息

通过在小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)中过表达缝隙连接蛋白43基因(Cx43),探究Cx43对小梅山猪BMSCs增殖及凋亡的影响,为构建转基因动物模型奠定基础。利用分子技术构建Cx43真核表达载体p EGFP-Cx43,Nucleofector TM法转染P3代BMSCs,检测细胞转染效率,经RT-PCR、免疫荧光和Western blotting鉴定Cx43的表达,流式细胞技术分析BMSCs的增殖能力和凋亡情况。酶切鉴定和测序结果表明,p EGFP-Cx43真核表达载体构建成功,转染BMSCs后,EGFP阳性细胞约占60%。转基因BMSCs中Cx43蛋白表达显著增加,细胞增殖能力显著提高、凋亡率显著下降。结果表明,在小梅山猪BMSCs中过表达Cx43不仅能促进细胞增殖而且抑制其凋亡,为下一步在体研究奠定了基础。

关键词： Cx43基因小梅山猪真核表达载体骨髓间充质干细胞

RS-1提高CRISPR-Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因敲入效率

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生物工程学报 2017年第8期33卷 1224-1234页

作者：周文君郭日红邓明田王锋张艳丽南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

尝试利用CRISPR-Cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白(BLG)基因,以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白(h LF)基因,并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂(RS-1)对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sg RNA和Cas... 详细信息

尝试利用CRISPR-Cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白(BLG)基因,以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白(h LF)基因,并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂(RS-1)对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sg RNA和Cas9共表达载体p Cas9-sg BLG,将该载体转染至山羊耳成纤维细胞,利用PCR和T7EN1法验证了其基因组编辑活性;然后进一步构建了BLG基因打靶载体p BHA-h LF-NIE(包含NEO/EGFP);将该打靶载体与p Cas9-sg BLG载体共转染至山羊耳成纤维细胞,分别用0、5、10和20μmol/L RS-1处理细胞,分析了绿色荧光蛋白的表达效率;同时用800μg/m L G418对不同浓度RS-1处理后的细胞进行筛选,挑取EGFP阳性细胞克隆,进一步通过PCR和测序鉴定h LF定点敲入的阳性细胞克隆。结果显示:设计的sg RNA编辑山羊BLG位点的效率为25%-31%;报告基因的表达效率提示RS-1可以促进基因敲入效率的提高,其效率与RS-1浓度呈正相关,20μmol/L RS-1处理组的效率是对照组的3.5倍;利用G418筛选h LF敲入阳性细胞克隆后,当RS-1浓度为0-10μmol/L时,h LF敲入效率随着RS-1浓度增加而升高,在10μmol/L时阳性克隆率最高为32.61%,然而在20μmol/L时敲入阳性克隆率下降至22.22%,且衰老细胞克隆增多。以上结果表明,利用CRISPR-Cas9系统可以实现在山羊耳成纤维细胞中敲除BLG基因和敲入h LF基因,且适宜浓度的RS-1可以显著提升基因敲入效率,本试验为高效利用CRISPR-Cas9系统获得基因敲入的细胞提供了参考依据。

关键词： CRISPR-Cas9 RS-1 β-乳球蛋白同源重组人乳铁蛋白山羊耳成纤维细胞

日粮添加紫苏籽对湖羊肝脏部分自噬与凋亡相关基因表达的影响

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南京农业大学学报 2022年第2期45卷 333-340页

作者：梁雅旭邓凯平张真高霄霄王智博王锋樊懿萱南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

[目的]本试验旨在探究日粮中添加富含多不饱和脂肪酸的15%紫苏籽(PFS)对湖羊肝脏自噬和凋亡的影响。[方法]选取30只体重相近且健康状况良好的2月龄湖羊公羔,随机分为2组,分别饲喂含0%(对照)和15%PFS的日粮。饲养84 d后,每组随机选择5只... 详细信息

[目的]本试验旨在探究日粮中添加富含多不饱和脂肪酸的15%紫苏籽(PFS)对湖羊肝脏自噬和凋亡的影响。[方法]选取30只体重相近且健康状况良好的2月龄湖羊公羔,随机分为2组,分别饲喂含0%(对照)和15%PFS的日粮。饲养84 d后,每组随机选择5只羊屠宰,采集肝脏组织。通过qPCR和Western blot等技术检测肝脏中自噬、凋亡及LKB1-AMPK-MTOR信号通路相关基因与蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比,15%PFS显著上调PPARGC1A、BECN1、ATG5、ATG7基因和PPARGC1A、BECN1蛋白表达水平(P0.05);15%PFS组肝脏组织中LKB1-AMPK-MTOR通路关键基因LKB1、AMPK和MTOR mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。[结论]紫苏籽可能通过调控LKB1-AMPK-MTOR信号通路和自噬相关基因与蛋白的表达水平,进而调控湖羊肝脏自噬进程。

关键词：湖羊紫苏籽自噬凋亡

山羊生殖细胞特异报告载体pVASA-EGFP的构建及表达

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生物工程学报 2015年第9期31卷 1313-1324页

作者：颜光耀李佩真任才芳王锋张艳丽南京农业大学动物科技学院江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

为监测成体干细胞向生殖细胞分化的过程,分析生殖细胞特异性DEAD-box家族ATP依赖RNA解旋酶vasa在不同日龄山羊睾丸组织中的表达情况并构建山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP。通过免疫荧光及RT-PCR法监测vasa的表达情况,利用分子... 详细信息

为监测成体干细胞向生殖细胞分化的过程,分析生殖细胞特异性DEAD-box家族ATP依赖RNA解旋酶vasa在不同日龄山羊睾丸组织中的表达情况并构建山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP。通过免疫荧光及RT-PCR法监测vasa的表达情况,利用分子技术构建报告载体p VASA-EGFP,脂质体法转染山羊骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),经过视黄酸(Retinoic acid,RA)诱导后,观察绿色荧光蛋白表达情况以鉴定该报告载体的有效性。免疫荧光结果显示,Vasa在性成熟不同阶段的山羊睾丸组织中均有表达,RT-PCR结果表明vasa基因在3月龄、10月龄山羊睾丸组织中显著高于10日龄组。测序及酶切鉴定结果表明,扩增的vasa基因启动子片段成功连至N1载体,转染BMSCs后经4 d的RA诱导,发现有绿色荧光蛋白表达,表明成功构建了山羊vasa基因启动子调控的报告载体p VASA-EGFP。以上结果表明,vasa基因在不同日龄山羊睾丸组织中均有表达,所构建的山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP具有示踪山羊成体干细胞向生殖细胞分化过程的能力,为下一步监测山羊BMSCs向生殖细胞分化的过程提供了鉴定和筛选方法。

关键词： DEAD-box家族ATP依赖RNA解旋酶启动子生殖细胞视黄酸骨髓间充质干细胞山羊

过表达Kdm4d对山羊孤雌胚胎基因组激活期Xist表达的影响

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南京农业大学学报 2022年第6期45卷 1227-1234页

作者：杨瑛楠蔡玉刘孜斐李东旭万永杰王锋邓明田南京农业大学动物科技学院江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

[目的]本试验旨在探究过表达赖氨酸特异去甲基化酶4D(Kdm4d)对山羊孤雌胚胎基因组激活期(8细胞期)Xist表达的影响。[方法]通过构建Kdm4d-IRES-EGFP重组质粒,体外转录Kdm4d mRNA,再利用显微注射、免疫荧光和亚硫酸氢盐测序等方法,分析过... 详细信息

[目的]本试验旨在探究过表达赖氨酸特异去甲基化酶4D(Kdm4d)对山羊孤雌胚胎基因组激活期(8细胞期)Xist表达的影响。[方法]通过构建Kdm4d-IRES-EGFP重组质粒,体外转录Kdm4d mRNA,再利用显微注射、免疫荧光和亚硫酸氢盐测序等方法,分析过表达Kdm4d对山羊孤雌胚胎基因组激活期(8细胞期)Xist表达的影响。[结果]与对照组相比,组蛋白H3K9甲基化(H3K9me3)水平在2~8细胞期和囊胚期过表达Kdm4d的山羊孤雌胚胎中均显著降低,过表达Kdm4d山羊的4、8细胞期胚胎和囊胚的发育潜能无显著变化;Xist表达水平在过表达Kdm4d的山羊8细胞期孤雌胚胎中显著升高,但Xist启动子仍维持高甲基化,与对照组相比无显著变化。[结论]Kdm4d能有效移除孤雌胚胎中H3K9me3修饰,促进Xist表达,但不影响Xist启动子DNA甲基化水平和山羊孤雌胚胎发育潜能。本研究为深入理解Kdm4d调控山羊早期胚胎X染色体失活的机制奠定了基础。

关键词： Kdm4d Xist 孤雌胚胎胚胎基因组激活山羊

Zic3基因在小梅山猪骨髓间充质干细胞中的表达

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南京农业大学学报 2014年第5期37卷 111-116页

作者：樊懿萱王强王锋张艳丽南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序... 详细信息

构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序鉴定构建的载体是否正确。体外培养小梅山猪BMSC,通过免疫细胞化学法检测小梅山猪BMSC表面标志。采用脂质体法将pEGFP-Zic3转染BMSC,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在小梅山猪BMSC内的表达和定位,用RT-PCR法检测Zic3的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。双酶切和测序证实已成功构建含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3;小梅山猪BMSC体外培养状态良好,且表达CD29,不表达CD34和CD45;pEGFP-Zic3转染BMSC后可见大量绿色荧光,与对照组相比,转Zic3基因BMSC增殖能力提高,但细胞凋亡率未发生明显变化。结论:成功构建了含目的基因Zic3的真核表达载体pEGFP-Zic3,并高效转染BMSC,Zic3表达增加,且Zic3可提高细胞增殖能力。

关键词： Zic3基因小梅山猪真核表达骨髓间充质干细胞

胚龄、季节和胚胎数量对转人乳铁蛋白基因克隆奶山羊生产效率的影响

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南京农业大学学报 2015年第6期38卷 980-985页

作者：万永杰肖慎华邓明田张国敏贾若欣张艳丽王锋黄明睿南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室江苏南京210095

[目的]研究不同的胚龄、移植季节以及胚胎数量对转人乳铁蛋白基因（hLF）体细胞克隆山羊生产效率的影响.[方法]用奶山羊的转hLF基因成纤维细胞为供体细胞生产克隆胚胎,并以不同的胚龄、胚胎数量,在不同的季节移植给同期的受体山羊.[结果... 详细信息

[目的]研究不同的胚龄、移植季节以及胚胎数量对转人乳铁蛋白基因（hLF）体细胞克隆山羊生产效率的影响.[方法]用奶山羊的转hLF基因成纤维细胞为供体细胞生产克隆胚胎,并以不同的胚龄、胚胎数量,在不同的季节移植给同期的受体山羊.[结果]移植1细胞期和2-8细胞期胚胎受体羊的妊娠率（分别是17.95%和28.57%）、产羔率（分别是12.82%和14.29%）显著高于移植桑椹胚、囊胚的受体羊（3.70%和0,P〈0.05）;转hLF基因克隆胚胎在秋季移植效率最高,虽然秋季和春季受体羊妊娠率（分别是19.57%和18.18%）与冬季（10.34%）差异不显著,但秋季受体羊产羔率（13.04%）显著高于冬季（1.72%,P〈0.05）;虽然移植10-20枚克隆胚胎的受体羊妊娠率（18.18%）显著高于移植5-9枚胚胎的受体羊（7.89%）,但是由于其流产率高,两者产羔率差异并不显著（7.89% vs 6.36%,P〉0.05）.[结论]转基因克隆山羊胚胎移植试验的最适季节是秋季,最好移植激活后体外培养2 d内的胚胎.

关键词：转基因克隆胚胎移植妊娠率产羔率奶山羊