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类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4调控芹菜不同组织的着色

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中国农业科学 2021年第15期54卷 3279-3294页

作者：王昊尹莲刘洁霞贾丽丽丁旭沈迪冯凯徐志胜熊爱生南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室

【目的】研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4在不同颜色芹菜中的基因型及相对表达量,结合类胡萝卜素含量测定,分析AgCCD4对芹菜组织中类胡萝卜素积累的影响,为进一步研究CCD亚家族基因在不同颜色芹菜组织着色中的作用奠定基础。【方... 详细信息

【目的】研究类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4在不同颜色芹菜中的基因型及相对表达量,结合类胡萝卜素含量测定,分析AgCCD4对芹菜组织中类胡萝卜素积累的影响,为进一步研究CCD亚家族基因在不同颜色芹菜组织着色中的作用奠定基础。【方法】采用同源比对法检索芹菜基因组中的CCD家族基因AgCCD4。从‘津南实芹’‘黄太极’‘紫杆一号’和‘赛雪’4种不同颜色芹菜中分别克隆获得芹菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因AgCCD4。对芹菜AgCCD4的蛋白氨基酸序列组成、蛋白质理化性质、亲缘关系、空间结构等进行分析,预测其保守结构域和二级结构以及建立三级结构模型。采用荧光定量PCR技术检测AgCCD4在不同颜色芹菜不同组织中的表达水平。采用超高效液相色谱(UPLC)对4种颜色芹菜的叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定。采用农杆菌介导的瞬时表达转化法,研究AgCCD4蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。【结果】序列分析结果表明AgCCD4包含1个长度为1 779 bp的开放阅读框(ORF),编码592个氨基酸。‘赛雪’中AgCCD4的核苷酸序列与其他品种相比存在18个碱基和9个氨基酸位点的差异,蛋白质相对分子质量分别为65.07 kD和65.12 kD,等电点分别为6.03和5.95。进化树分析表明,芹菜AgCCD4与菊科的向日葵和莴苣CCD4进化关系较近。AgCCD4蛋白的二级结构中包含多个α-螺旋和无规则卷曲,三级结构主要以β-折叠为主。亚细胞定位分析表明AgCCD4是一个定位在叶绿体上的蛋白。对4种颜色芹菜叶片、叶柄和根中叶黄素和β-胡萝卜素的含量进行测定,结果显示芹菜根中均未检测到叶黄素和β-胡萝卜素,叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量均以‘津南实芹’最高,分别为1 102.58μg·g-1 DW和241.92μg·g-1DW,‘紫杆一号’最低,分别为57.12μg·g-1 DW和45.65μg·g-1 DW。在叶柄中,仅在‘黄太极’中检测到β-胡萝卜素,叶黄素也只在‘津南实芹’和‘黄太极’中被检测到。荧光定量PCR结果显示,AgCCD4在芹菜叶片中表达量最高,在根中最低。‘紫杆一号’和‘赛雪’叶片中AgCCD4的相对表达量相似,都显著高于‘津南实芹’和‘黄太极’。【结论】本研究从4种颜色芹菜中分别克隆得到AgCCD4,其中‘赛雪’的基因序列和其他品种存在差异,其蛋白均含有RPE65保守结构域。AgCCD4表达量在芹菜不同组织中具有显著差异。芹菜中AgCCD4表达量与类胡萝卜素含量呈负相关。植物体中类胡萝卜素的含量和种类影响植株的颜色变化,AgCCD4可能通过降解类胡萝卜素来调控芹菜组织着色。

关键词：芹菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因亚细胞定位基因表达类胡萝卜素

胡萝卜WRKY69基因(DcWRKY69)的克隆及其对不同植物生长调节剂的响应

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植物资源与环境学报 2019年第4期28卷 1-10页

作者：张榕蓉王雅慧李彤丁旭徐志胜熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室

以胡萝卜品种‘黑田五寸’(Daucus carota ***‘Heitian Wucun’)为研究对象,采用RT-PCR技术从叶片cDNA中克隆获得DcWRKY69基因片段,并对该基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;同时,采用RT-qPCR技术比较了0.1 mmol·L^-1茉莉... 详细信息

以胡萝卜品种‘黑田五寸’(Daucus carota ***‘Heitian Wucun’)为研究对象,采用RT-PCR技术从叶片cDNA中克隆获得DcWRKY69基因片段,并对该基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;同时,采用RT-qPCR技术比较了0.1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)、1.0 mmol·L^-1水杨酸(SA)、0.1 mmol·L^-1赤霉素(GA3)和0.1 mmol·L^-1脱落酸(ABA)处理12 h内叶中DcWRKY69基因相对表达量的差异。结果表明:DcWRKY69基因包含1个长度为783 bp的开放阅读框(ORF),编码260个氨基酸;DcWRKY69转录因子氨基酸序列在第52至第110位含有1个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2 H2型,理论相对分子质量为30030,理论等电点为pI 4.78;该转录因子含有34个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构,亲水性氨基酸较多,且酸性氨基酸比例最高(27%);该转录因子的二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链和随机卷曲组成,比例分别为21.92%、4.23%、11.92%和61.92%。序列比对和系统进化树分析结果表明:WRKY转录因子在植物进化过程中具有高度的保守性。RT-qPCR分析结果表明:经MeJA、SA、GA3和ABA处理后,DcWRKY69基因相对表达量的变化趋势不同,分别在处理后8、12、1和4 h达到峰值,且显著高于对照(处理0 h)。研究结果显示:DcWRKY69转录因子属于Ⅱ类WRKY转录因子,为亲水性蛋白,且可能属于非分泌蛋白;DcWRKY69基因可能参与胡萝卜对不同植物生长调节剂的响应过程,但其对不同植物生长调节剂的响应模式存在差异。

关键词：胡萝卜 WRKY69转录因子基因克隆序列分析植物生长调节剂基因表达

胡萝卜转录因子Dc BZR1基因的克隆及组织表达特异性分析

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植物生理学报 2021年第2期57卷 451-460页

作者：王欣蕊王雅慧张榕蓉徐志胜熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京210095

本研究以胡萝卜(Daucus carota ssp. sativus)‘黑田五寸’为试验材料克隆得到DcBZR1基因。该基因开放阅读框长939 bp,编码312个氨基酸。氨基酸序列比对和保守结构域分析结果表明DcBZR1含有bHLH结构域,属于BZR1/BES1家族。利用实时荧光... 详细信息

本研究以胡萝卜(Daucus carota ssp. sativus)‘黑田五寸’为试验材料克隆得到DcBZR1基因。该基因开放阅读框长939 bp,编码312个氨基酸。氨基酸序列比对和保守结构域分析结果表明DcBZR1含有bHLH结构域,属于BZR1/BES1家族。利用实时荧光定量PCR技术检测‘黑田五寸’(橙色)、‘紫宙’(紫色)和‘白玉’(白色)胡萝卜不同组织中和不同发育阶段下DcBZR1基因的相对表达水平,结果表明:不同组织中, DcBZR1基因均有表达且具有组织表达特异性,在根中的表达量最高;不同发育阶段下,各品种胡萝卜DcBZR1基因的相对表达水平变化规律基本一致,在播种后75 d时达到峰值;不同根色胡萝卜材料中, DcBZR1基因在橙色胡萝卜‘黑田五寸’中的表达水平较高。研究结果表明DcBZR1可能与类胡萝卜素合成相关并在胡萝卜肉质根发育过程中发挥重要作用。

关键词：胡萝卜 BZR1 基因克隆表达分析类胡萝卜素

芹菜β-胡萝卜素羟化酶基因AgBCH1的克隆及表达特性分析

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植物生理学报 2019年第1期55卷 14-22页

作者：王雨薇郝建楠罗鑫李静文段奥其刘洁霞冯凯熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室南京210095

胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase, BCH)在植物类胡萝卜素生物合成中起着重要的作用。芹菜是伞形科一种重要的叶菜类蔬菜作物,含有丰富的类胡萝卜素。本文以芹菜‘六合黄心芹’为实验材料,从中克隆获得编码芹菜β-胡萝卜素羟化... 详细信息

胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase, BCH)在植物类胡萝卜素生物合成中起着重要的作用。芹菜是伞形科一种重要的叶菜类蔬菜作物,含有丰富的类胡萝卜素。本文以芹菜‘六合黄心芹’为实验材料,从中克隆获得编码芹菜β-胡萝卜素羟化酶的基因AgBCH1。序列分析结果显示,该基因全长933 bp,编码310个氨基酸。进化树分析表明,芹菜AgBCH1蛋白的进化高度保守,与同科的胡萝卜DcBCH1蛋白的进化关系最为相近。序列比对分析显示,植物BCH1氨基酸序列具有较高的同源性,芹菜与同科的胡萝卜BCH1氨基酸序列一致性达到87.94%。Ag BCH1蛋白相对分子质量34 505.73,理论等电点9.10,为亲水性蛋白。芹菜Ag BCH1蛋白三级蛋白结构包括5个α螺旋及6个β折叠,无序化比例为14.84%。利用实时定量PCR对经过低温(4°C)、高温(38°C)、盐(0.2mol·L-1 Na Cl)、干旱(200 g·L-1 PEG) 4种非生物胁迫处理的60 d芹菜叶片中Ag BCH1基因的相对表达量进行检测,发现Ag BCH1基因对这4种逆境胁迫均有响应,尤其对高温胁迫响应明显,且高温处理8 h后表达量最高。

关键词：芹菜 β-胡萝卜素羟化酶基因克隆非生物胁迫基因表达

白菜(Brassica campestris ***)BcMAX2调控腋芽生长的功能分析

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园艺学报 2023年第5期50卷 972-984页

作者：徐兰兰赵天孜张玮宗琛黄菲艺王建军侯喜林李英南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室南京210095

MAX2(MORE AXILLARY GROWTH 2)是独脚金内酯信号转导相关基因,其功能与腋芽生长有关。以白菜(Brassica campestris ***)分蘖菜品种‘马耳头’和普通白菜品种‘苏州青’为材料,探究MAX2对腋芽生长的影响。结果表明:从两种材料中克隆得到... 详细信息

MAX2(MORE AXILLARY GROWTH 2)是独脚金内酯信号转导相关基因,其功能与腋芽生长有关。以白菜(Brassica campestris ***)分蘖菜品种‘马耳头’和普通白菜品种‘苏州青’为材料,探究MAX2对腋芽生长的影响。结果表明:从两种材料中克隆得到的BcMAX2其开放阅读框序列没有差异,‘马耳头’的BcMAX2启动子序列有2个碱基的缺失。亚细胞定位分析表明BcMAX2定位在细胞核。在拟南芥中过表达BcMAX2抑制腋芽生长,BRC1表达量升高。在‘马耳头’中沉默BcMAX2能引起BcBRC1表达量降低并促进腋芽伸长。通过对白菜cDNA文库筛选得到197个与BcMAX2互作的候选蛋白,其中多数候选互作蛋白具有结合活性和催化活性,部分候选蛋白还参与植物的信号转导和逆境响应。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证最终得到2个与BcMAX2互作的蛋白。试验表明,白菜BcMAX2可能通过促进BcBRC1的表达来负调控腋芽的生长。

关键词：白菜腋芽生长 BcMAX2 BcBRC1

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不结球白菜BcGR2.1基因的功能验证及响应光氧化胁迫研究

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南京农业大学学报 2023年第5期46卷 841-851页

作者：陶瑜李燕柏艾梅虞章红侯喜林李英南京农业大学作物遗传与种质创新利用全国重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺作物种质创新与利用教育部工程研究中心/园艺学院江苏南京210095

[目的]本文旨在研究不结球白菜BcGR2.1基因在光氧化胁迫下的表达模式,并探索过表达或沉默该基因对植物抗光氧化胁迫的影响,以明确基因的功能。[方法]从不结球白菜中克隆了BcGR2.1基因CDS序列,对其编码的氨基酸序列进行进化树和保守区域... 详细信息

[目的]本文旨在研究不结球白菜BcGR2.1基因在光氧化胁迫下的表达模式,并探索过表达或沉默该基因对植物抗光氧化胁迫的影响,以明确基因的功能。[方法]从不结球白菜中克隆了BcGR2.1基因CDS序列,对其编码的氨基酸序列进行进化树和保守区域分析;采用RT-qPCR技术,对BcGR2.1基因在光氧化胁迫处理下的表达水平进行分析;利用农杆菌介导的蘸花法和病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术分别获得BcGR2.1过表达拟南芥和BcGR2.1沉默不结球白菜植株,并验证过表达或沉默BcGR2.1基因对植物抗光氧化胁迫能力的影响。[结果]不结球白菜BcGR2.1基因ORF全长1626 bp,与芜菁GR2蛋白进化关系最近。在甲基紫精(MV)处理诱导的光氧化胁迫下,该基因一定时间内表达量上调,随后下调。过表达转基因拟南芥中抗坏血酸(AsA)含量上升,而沉默植株中AsA含量下降。光氧化胁迫条件下,过表达转基因拟南芥中的H_(2)O_(2)含量显著低于野生型,而BcGR2.1沉默植株中H_(2)O_(2)含量显著高于PTY空载植株;此外,过表达BcGR2.1拟南芥中相关叶绿素荧光动力学参数F v/F m、Y(Ⅱ)、ETR以及qP均显著高于野生型。[结论]在拟南芥和不结球白菜中BcGR2.1正调控AsA含量,抑制光氧化胁迫处理下植株体内H_(2)O_(2)的爆发,一定程度上维护了植株叶绿素荧光参数的正常状态,提高了植物对光氧化胁迫的耐受性。

关键词：不结球白菜 BcGR2.1 光氧化胁迫抗坏血酸(AsA) 叶绿素荧光参数

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芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

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园艺学报 2016年第11期43卷 2193-2202页

作者：吴蓓李梦瑶王广龙黄蔚王枫熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京210095

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物... 详细信息

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。

关键词：芹菜乙烯反应元件结合蛋白酵母单杂交非生物胁迫基因表达

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紫菜薹BrbHLH49基因克隆与功能分析

南京农业大学学报 2021年第3期44卷 421-427页

作者：王建军徐园园刘同坤侯喜林南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺学院江苏南京210095

[目的]本文旨在研究紫菜薹BrbHLH49基因在花青素合成中的功能。[方法]以紫菜薹为材料,通过同源克隆获得BrbHLH49基因全长序列,并与其他物种中的同源序列进行进化树分析;构建pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP载体并转化导入烟草叶片中,研究Brb... 详细信息

[目的]本文旨在研究紫菜薹BrbHLH49基因在花青素合成中的功能。[方法]以紫菜薹为材料,通过同源克隆获得BrbHLH49基因全长序列,并与其他物种中的同源序列进行进化树分析;构建pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP载体并转化导入烟草叶片中,研究BrbHLH49蛋白的亚细胞定位;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrbHLH49基因在紫菜薹和‘四九菜心’(‘CX-49’)不同组织中的表达情况,同时分析野生型和35S∶BrbHLH49-YFP转基因拟南芥中花青素合成相关基因的表达。[结果]BrbHLH49基因含有1431 bp开放阅读框,编码476个氨基酸,其编码的蛋白定位于细胞核中。在进化过程中BrbHLH49编码的氨基酸序列与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,紫菜薹的薹和叶中BrbHLH49相对表达量均显著高于‘CX-49’,且BrbHLH49转基因拟南芥植株中花青素合成相关基因的表达量显著高于野生型。[结论]BrbHLH49蛋白定位于细胞核中。BrbHLH49基因在紫菜薹的薹和叶中高表达,且拟南芥中过表达该基因能显著提高花青素的合成。

关键词：紫菜薹 BrbHLH49基因功能分析花青素

萝卜细胞质雄性不育性遗传机制及其利用研究进展

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南京农业大学学报 2022年第5期45卷 883-897页

作者：柳李旺李冰霜董俊辉张晓莉王燕徐良南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺学院江苏南京210095

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)在萝卜与近缘芸薹属作物杂种优势利用中起着重要作用,CMS育性机制的研究有助于揭示细胞核-质互作的分子基础。萝卜CMS不育类型主要有Ogura、Kos、NWB和DCGMS等。Ogura CMS起源于日本野... 详细信息

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)在萝卜与近缘芸薹属作物杂种优势利用中起着重要作用,CMS育性机制的研究有助于揭示细胞核-质互作的分子基础。萝卜CMS不育类型主要有Ogura、Kos、NWB和DCGMS等。Ogura CMS起源于日本野生萝卜,多在四分体-单核小孢子期败育;NWB和DCGMS CMS起源于欧洲野生萝卜,败育发生在单核小孢子时期。现已鉴定到多个萝卜CMS不育基因(orf 138、orf125、orf463和orf463a等)及育性恢复基因(Rfo、Rf3、Rfs、Rfk1和Rfd1等)。通过分析不育基因与恢复基因(Rf)的遗传模式、结构特征和相互作用,初步阐明了萝卜Ogura CMS形成与育性恢复机制,即Rf基因所编码的PPR-B蛋白特异结合不育基因orf 138 mRNA,充当核糖体阻断剂特异性地阻止翻译延伸,从而降低ORF138蛋白含量以恢复育性,但是PPR-B蛋白上的结合位点尚需鉴定。此外,本文还对育性恢复基因标记开发、雄性不育系转育以及作为近缘种的不育胞质源等萝卜CMS不育胞质利用相关领域研究进展进行了阐述,并展望了CMS不育性遗传机制与利用领域存在的问题及研究重点。

关键词：萝卜细胞质雄性不育恢复基因遗传机制研究进展