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联苯菊酯酶联免疫吸附分析方法研究

分析化学 2008年第1期36卷 34-38页

作者：李波施海燕王鸣华南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

建立了定量测定联苯菊酯的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。利用联苯菊酯的代谢物联苯醇合成了联苯菊酯的半抗原LBc(2-甲基-3-苯基苄基氧基羰基丙酸)和LBy(2-甲基-3-苯基苯甲酸)。通过碳二亚胺法将LBc交联于牛血清蛋白(BSA)作... 详细信息

建立了定量测定联苯菊酯的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。利用联苯菊酯的代谢物联苯醇合成了联苯菊酯的半抗原LBc(2-甲基-3-苯基苄基氧基羰基丙酸)和LBy(2-甲基-3-苯基苯甲酸)。通过碳二亚胺法将LBc交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原(LBc-BSA),通过活泼酯法将LBc和LBy分别交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原(LBc-OVA和LBy-OVA),LBc-BSA为免疫原制备了联苯菊酯的兔抗血清,间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达5.12×104。通过同源异源分析,发现异源分析的灵敏度较高,对pH值、离子强度、甲醇含量等影响因素进行了研究,0.3mol/L钠离子强度的磷酸缓冲液(pH7.5)和30%的甲醇确定为联苯菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件,该方法的IC50为2.16±0.32mg/L,检出限(LDL)为0.016±0.002mg/L。对大部分拟除虫菊酯,如三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和拟除虫菊酯的代谢物3-苯氧基苯甲酸没有明显的交叉反应。

关键词：联苯菊酯多克隆抗体酶联免疫吸附分析

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重金属汞单克隆抗体的制备及鉴定

高技术通讯 2008年第5期18卷 531-536页

作者：杨凤丽朱晓霞胡白石徐丽娜娄旸刘凤权南京农业大学植物保护学院农业部病虫监测与治理重点实验室南京210095

通过双功能螯合剂（异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸，ITCBE）使汞离子与载体蛋白（匙孔血蓝蛋白，KLH）偶联，获得了免疫抗原KLH-ITCBE-Hg（II）。以该抗原免疫BALB／C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞用ELISA方法... 详细信息

通过双功能螯合剂（异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸，ITCBE）使汞离子与载体蛋白（匙孔血蓝蛋白，KLH）偶联，获得了免疫抗原KLH-ITCBE-Hg（II）。以该抗原免疫BALB／C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞用ELISA方法筛选及有限稀释法亚克隆化，获得了5株可稳定分泌抗汞单克隆抗体的杂交瘤细胞株（E／H9、E／B2、1／F11、1／H7和B／B11）。杂交瘤细胞染色体数目在97—104之间，所分泌的抗体均为IgM、k型，其中杂交瘤细胞株E／H9、1／F11和B／B11细胞培养上清液效价分别达1：640、1：320、1：160，腹水效价分别达1：6400、1：3200、1：6400。B／B11的亲和常数为2．981×10^8L／mol，特异性试验表明：B／B11与其它金属离子的交叉反应率均小于2％，具有较高的特异性。高亲合力和高特异性的抗汞单克隆抗体在该研究中的成功制备，为建立农产品和环境中重金属汞的快速免疫检测方法奠定了基础。

关键词：汞单克隆抗体 ELISA

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大豆斑疹病菌harpin编码基因的克隆与特性研究

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微生物学报 2005年第4期45卷 496-499,i001页

作者：陈功友张兵武晓敏赵梅琴南京农业大学植物保护学院农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

根据黄单胞菌harpin编码基因的同源性,设计简并引物,采用PCR方法从大豆斑疹病菌(***,Xag)中克隆了402bp的hpa1同源基因,构建于表达载体pET30(a)上经转化大肠杆菌BL21菌株,获得基因工程菌BHR-3。基因工程菌诱导表达后经收集菌体和破碎细... 详细信息

根据黄单胞菌harpin编码基因的同源性,设计简并引物,采用PCR方法从大豆斑疹病菌(***,Xag)中克隆了402bp的hpa1同源基因,构建于表达载体pET30(a)上经转化大肠杆菌BL21菌株,获得基因工程菌BHR-3。基因工程菌诱导表达后经收集菌体和破碎细胞,得到表达产物为15.1kD的蛋白质。该蛋白质富含甘氨酸,不含半胱氨酸,对热稳定,对蛋白酶K敏感,可在非寄主烟草上激发过敏反应。激发的过敏反应需要植物体内水杨酸的积累,还可被真核生物代谢抑制剂抑制。序列比较显示,该基因与Xag中hpaG基因相同,与其它黄单胞菌中的hpa1基因有51.4%～93.8%的同源性,与其它革兰氏阴性植物病原细菌的harpin编码基因无同源性。据此把该基因产物鉴定为harpinXag。黄单胞菌harpin蛋白质序列比较发现,GG-GGG基序的多少并不是harpin蛋白的唯一特性。这为利用harpin蛋白开展植物病害控制的基因药物学设计提供了科学线索。

关键词：大豆斑疹病菌,烟草,过敏反应,harpin编码基因

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水稻黄单胞菌avrBs3/PthA家族基因研究进展

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中国农业科学 2007年第10期40卷 2193-2199页

作者：李玉蓉邹丽芳武晓敏杨娟陈功友南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)和稻生致病变种(***,Xooc)分别引起水稻白叶枯病(bacterialblight,BB)和水稻细菌性条斑病(bacterialleafstreak,BLS),对中国和世界水稻产量造成较大损失。基因组学揭示,Xoo和Xooc不同小种中存在15～30个数量不等的avrBs3/PthA(avr/pth)家族基因。新近研究结果表明,avr/pth基因既是毒性基因,又是寄主植物先天免疫的抑制因子,还是与抗病基因(R)匹配的无毒基因。Xooc中虽然存在avr/pth基因,但因存在能够抑制avr/pth无毒基因功能的抑制因子,故而未在水稻中发现抗BLS的R基因。除结构上的共有特征外,avr/pth基因间的差异主要表现在102bp重复单元在每个avr/pth基因中的重复数多少上。avr/pth基因的进化可能由简单进化为复杂,这可能是Xoo和Xooc致病性变异的主要原因。

关键词：水稻白叶枯病菌水稻条斑病菌 avrBs3/PthA家族致病性变异

中国主要稻区稻瘟病菌交配型分布及其育性能力的差异

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中国农业科学 2004年第6期37卷 840-845页

作者：陈庆河王源超郑小波南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

用4 个稻瘟病菌的标准交配型菌株,对1998～2003 年中国13个省(区)、市,670个稻瘟病菌单孢分离菌株的可育性和交配型进行了测定。结果表明,中国稻瘟病菌广泛存在MAT1-1、MAT1-2两种交配型菌株。可育菌株占测试菌株的40.3%,MAT1-1和MAT1-... 详细信息

用4 个稻瘟病菌的标准交配型菌株,对1998～2003 年中国13个省(区)、市,670个稻瘟病菌单孢分离菌株的可育性和交配型进行了测定。结果表明,中国稻瘟病菌广泛存在MAT1-1、MAT1-2两种交配型菌株。可育菌株占测试菌株的40.3%,MAT1-1和MAT1-2菌株分别为21.9%、18.4%。不同稻区稻瘟病菌有性世代的形成能力有很大差异。用PCR技术对中国稻瘟病菌交配型进行快速分子测定,发现MAT1-1和MAT1-2菌株分别占62.5%和37.5%,绝大多数稻区同时存在两种交配型菌株。结果提示,尽管在自然界中很难发现稻瘟病菌的有性世代,有性杂交导致的稻瘟病菌的遗传变异仍然是稻瘟病菌遗传多样性的一种潜在的原因。

关键词：稻瘟病菌交配型育性能力有性态

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

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中国农业科学 2008年第6期41卷 1655-1660页

作者：马玲莉霍蓉高学文何丹邵敏王琦南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae ***)编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介... 详细信息

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae ***)编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。

关键词： hrf2基因农杆菌介导转化法转基因油菜抗病性

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

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中国农业科学 2003年第5期36卷 528-535页

作者：陈功友余晓江王金生南京农业大学植物保护学院/农业部植物病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部植物病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xant... 详细信息

用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有

关键词：水稻白叶枯病菌水稻条斑病细菌 hrpXoo 过敏反应致病性

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水稻白叶枯病菌致病性分子遗传学基础

中国农业科学 2004年第9期37卷 1301-1307页

作者：陈功友邹丽芳王邢平向勇王金生南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

水稻-白叶枯病原菌互作符合基因对基因关系,是研究禾本科植物-病原菌互作的理想模式系统。目前已鉴定和克隆出许多白叶枯病菌致病相关基因。其它革兰氏阴性植物病原细菌致病性分子遗传学和基因组学研究,为揭示水稻白叶枯病菌致病性分子... 详细信息

水稻-白叶枯病原菌互作符合基因对基因关系,是研究禾本科植物-病原菌互作的理想模式系统。目前已鉴定和克隆出许多白叶枯病菌致病相关基因。其它革兰氏阴性植物病原细菌致病性分子遗传学和基因组学研究,为揭示水稻白叶枯病菌致病性分子机理提供了丰富的背景知识,其中以发掘TTSS效应分子的研究备受关注。本文将对白叶枯病菌致病性分子机理进行综述,以期为研究水稻-白叶枯病菌互作的功能基因组学提供科学线索。

关键词：水稻白叶枯病菌致病性效应分子过敏反应 Ш型泌出系统

中国水稻条斑病细菌avrBs3/PthA家族基因的克隆和序列分析

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中国农业科学 2005年第5期38卷 929-935页

作者：邹丽芳陈功友武晓敏王金生南京农业大学植物保护学院/农业部植物病虫监测与治理重点开放实验室南京农业大学植物保护学院/农业部植物病虫监测与治理重点开放实验室南京210095

水稻条斑病细菌(***,Xooc)和水稻白叶枯病菌(***,Xoo)是稻黄单胞菌种下的致病变种,是水稻上的模式病原菌。用Xoo无毒基因avrXa3对应的NLS和AD区域的DNA片段构建探针,筛选Xooc基因文库,再通过酶切归类和Southern杂交分析,从Xooc中获得2个... 详细信息

水稻条斑病细菌(***,Xooc)和水稻白叶枯病菌(***,Xoo)是稻黄单胞菌种下的致病变种,是水稻上的模式病原菌。用Xoo无毒基因avrXa3对应的NLS和AD区域的DNA片段构建探针,筛选Xooc基因文库,再通过酶切归类和Southern杂交分析,从Xooc中获得2个avBs3r/PthA家族基因克隆,分别被命名为avr/Pth13和avr/Pth14。序列测定结果显示,它们与avrBs3PthA家族成员,几乎一样的5′端和3′端、1个亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ)、3个核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS)和1个酸性转录活化域(acidictranscriptionalactivationdomain,AD),不同的只是102bp重复单元的重复次数不等:avr/Pth13基因102bp重复5.5次,avr/Pth14基因为19.5次。蛋白质水平上同列比较发现,AvrBs3/PthA家族成员34aa重复单元的第12和第13位氨基酸为HD的至少需要3个,才可能满足毒性或无毒性功能。将avr/Pth13和avr/Pth14基因分别导入Xoo菌株PXO99A中之后,在抗水稻白叶枯病近等基因系上测定其致病性,发现avr/Pth13基因增强了PXO99A的致病能力,而avr/Pth14基因则减弱了PXO99A的致病力。以上结果提示,Xooc与Xoo一样,都存在avrBs3/PthA基因家族的无毒基因。从Xooc中克隆avr/Pth13和avr/Pth14基因在国内外尚属首次,

关键词：水稻条斑病细菌 avrBs3/PthA基因家族 Southern杂交致病性