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仙鹤草-黄连通过调控分子伴侣介导自噬抑制结直肠癌的作用机制

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中国实验方剂学杂志 2024年第18期 61-71页

作者：何亚萍侯敏艳彭海燕南京中医药大学第一临床医学院南京中医药大学附属医院

目的：观察仙鹤草-黄连药对（XHC-HL）对结直肠肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及对自噬的影响，并探讨XHC-HL通过调控分子伴侣介导自噬（CMA）抑制结直肠癌的作用机制。方法：制备XHC-HL含药血清，培养人结直肠癌细胞株HT29和LOVO，分... 详细信息

目的：观察仙鹤草-黄连药对（XHC-HL）对结直肠肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及对自噬的影响，并探讨XHC-HL通过调控分子伴侣介导自噬（CMA）抑制结直肠癌的作用机制。方法：制备XHC-HL含药血清，培养人结直肠癌细胞株HT29和LOVO，分为空白组（20%空白血清），XHC-HL组（5%、10%、20%含药血清），5-氟尿嘧啶（5-FU）组。用细胞增殖与活性检测法（CCK-8）检测细胞活力；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）染色法检测细胞增殖能力；划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测XHC-HL对自噬关键分子酵母Atg6同系物-1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）及p62的影响；Western blot、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测XHC-HL对CMA相关蛋白和mRNA影响。结果：与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组均能抑制HT-29和LOVO细胞活力（P<0.01）。与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组均能够明显抑制HT-29和LOVO细胞的增殖能力（P<0.05,P<0.01）。与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组2种细胞迁移率均显著减弱（P<0.01），迁移到下室的数量均显著减少（P<0.01），细胞侵袭个数均降低（P<0.01），细胞凋亡增多（P<0.01）。Western blot结果显示，与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组2种细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ的表达明显增加（P<0.05,P<0.01），而p62的水平明显降低（P<0.05,P<0.01）；与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组2种细胞中溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)、热休克同源蛋白70(HSC70)、热休克蛋白90(HSP90)蛋白表达量均有不同程度的降低，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达水平显著增高（P<0.01）。与空白组比较，XHC-HL组和5-FU组2种细胞中LAMP2A、HSC70、HSP90 mRNA水平均下调，GAPDH mRNA表达水平显著上调（P<0.01）。结论：XHC-HL可通过抑制CMA活性，从而抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，诱导其自噬，并促进细胞凋亡。

关键词：结直肠癌仙鹤草-黄连药对分子伴侣介导自噬中医药治疗

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固本防哮饮对IL-4联合IL-13诱导的人支气管上皮细胞中CGRP/ILC2及GABA表达的影响

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中国实验方剂学杂志 2024年

作者：欧炜莹袁雪晶纪建建南京中医药大学附属医院南京中医药大学第一临床医学院

目的：观察固本防哮饮含药血清对白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）刺激的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）中降钙素相关基因肽（CGRP）、γ-氨基丁酸（GABA）及Ⅱ型固有淋巴细胞（ILC2）相关转录因子、细胞因子的表达，探究其... 详细信息

目的：观察固本防哮饮含药血清对白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）刺激的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）中降钙素相关基因肽（CGRP）、γ-氨基丁酸（GABA）及Ⅱ型固有淋巴细胞（ILC2）相关转录因子、细胞因子的表达，探究其改善支气管上皮细胞Ⅱ型炎症的可能机制。方法：用含有高（20%）、中（15%）、低（10%）剂量的固本防哮饮含药血清及孟鲁斯特钠（10%）含药血清对IL-4和IL-13联合刺激的BEAS-2B细胞进行干预，实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）法检测各组细胞中CGRP、GABA、粘蛋白（MUC）5AC、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、白细胞介素-25（IL-25）、白细胞介素-33（IL-33）、白细胞介素-5（IL-5）、GATA结合蛋白3（GATA3）、B细胞淋巴瘤/白血病11B （BCL11b）mRNA表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞CGRP、MUC5AC蛋白相对表达；免疫荧光技术检测CGRP和GABA在细胞中的相对表达；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测培养基上清和细胞上清中IL-33、MUC5AC、IL-5的蛋白含量；过碘酸-雪夫反应染色法（PAS染色）检测黏蛋白的分泌情况。结果：IL-4联合IL-13刺激细胞后，与正常组比较，各给药组CGRP、GABA、MUC5AC、TSLP、IL-25、IL-33 mRNA的表达量显著上升（P<0.01）；与模型组比较，固本防哮饮含药血清各剂量组可显著降低造模后细胞中CGRP、GABA、MUC5AC、IL-5、GATA3、BCL11b mRNA表达(P<0.01)，并表现出剂量依赖性。与正常组比较，模型组CGRP、GABA、MUC5AC、IL-33和IL-5蛋白表达增加（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，固本防哮饮含药血清各剂量组细胞中CGRP、GABA、MUC5AC、IL-33和IL-5的蛋白表达显著降低(P<0.05，P<0.01)。与正常组比较，模型组CGRP和GABA的平均荧光强度明显升高（P<0.01）；与模型组比较，固本防哮饮含药血清各剂量组中CGRP和GABA的平均荧光强度显著降低（P<0.01）。与正常组比较，模型组中粘蛋白的分泌增多；与模型组比较，固本防哮饮含药血清各剂量组中黏蛋白的分泌减少。结论：固本防哮饮通过减轻Ⅱ型免疫性气道炎症和减少气道粘液分泌，达到防治支气管哮喘的目的，其可能的机制是固本防哮饮降低了CGRP、GABA、 MUC5AC及ILC2相关转录因子的表达。

关键词：支气管哮喘固本防哮饮降钙素相关基因肽 γ-氨基丁酸 Ⅱ型固有淋巴细胞

清心滋肾汤治疗阴虚火旺型绝经综合征的临床疗效及调节KNDy的神经内分泌机制

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中国实验方剂学杂志 2024年第6期30卷 119-125页

作者：周雨欣张镕晴卢苏许美娟陈赟南京中医药大学第一临床医学院南京210023 南京中医药大学附属医院江苏省中医院南京210029

目的:探究清心滋肾汤对绝经综合征阴虚火旺型患者治疗前后的综合疗效、症状评分、神经内分泌指标的影响及其调节KNDy神经元的作用机制。方法:选取60例于南京中医药大学附属江苏省中医院更年期专病门诊就诊且符合绝经综合征阴虚火旺诊断... 详细信息

目的:探究清心滋肾汤对绝经综合征阴虚火旺型患者治疗前后的综合疗效、症状评分、神经内分泌指标的影响及其调节KNDy神经元的作用机制。方法:选取60例于南京中医药大学附属江苏省中医院更年期专病门诊就诊且符合绝经综合征阴虚火旺诊断的患者,随机分为观察组(清心滋肾汤组)和对照组(芬吗通组)各30例,观察期为12周,比较两组治疗前后综合疗效、潮热汗出次数及程度、改良Kupperman评分、下丘脑神经元活性肽Kisspeptin、神经激肽B(NKB)、强啡肽(Dyn)、卵泡刺激素(FSH)和雌二醇(E2)在血清学水平的变化。结果:①临床综合疗效比较。治疗后,与对照组比较,两组患者综合疗效相当,差异无统计学意义。②潮热、汗出次数及程度比较。与本组治疗前比较,治疗后两组患者潮热、汗出次数及程度均明显降低(P临床证候群,其主要机制是作用于下丘脑KNDy神经元通路,下调Kisspeptin、NKB水平,上调Dyn水平,进一步缓解绝经综合征症状及改善患者血清性激素水平。该研究为中医药治疗绝经综合征潮热症状提供新思路。

关键词：绝经综合征清心滋肾汤 KNDy神经元作用机制

基于LAMP2A介导的自噬探讨仙鹤草-黄连含药血清对结直肠癌细胞的作用及机制研究

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中国中药杂志 2024年

作者：何亚萍侯敏艳沈鑫玲李智育徐敏陈轩张淑娟熊晗彭海燕南京中医药大学第一临床医学院南京中医药大学附属医院

探讨仙鹤草-黄连 (Agrimoniae Herba-Coptidis Rhizoma，XHC-HL) 含药血清通过溶酶体相关膜蛋白2A型(lysosome-associated membrane protein type 2A，LAMP2A) 介导的自噬对人结直肠癌HT29和HCT116细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。通过生物信息学分析LAMP2A在结直肠癌的发生发展中的作用机制；蛋白免疫印迹（Western blot，WB）检测LAMP2A蛋白在结直肠癌细胞株中的表达；利用慢病毒转染技术构建LAMP2A干扰HT29及过表达HCT116结直肠癌细胞模型；实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）实验检测转染效率；结直肠癌HT29和HCT116 细胞分别给予不同浓度的仙鹤草-黄连含药血清，采用cell counting kit-8 (CCK-8) 法检测细胞增殖，筛选含药血清最佳干预浓度及时间。将HT29细胞分为NC（空白对照）组、XHC-HL（仙鹤草-黄连药对处理）组、XHC-HL+shLAMP2A（仙鹤草-黄连药对处理+干扰LAMP2A）组；将HCT116细胞分为NC（空白对照）组、XHC-HL（仙鹤草-黄连药对处理）组、XHC-HL+LAMP2A（仙鹤草-黄连药对处理+过表达LAMP2A）组，CCK-8检测细胞活力；平板克隆实验检测细胞增殖能力；划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blot 技术和real-time PCR技术检测仙鹤草-黄连药对对结直肠癌细胞LAMP2A、热休克蛋白70 (the heat shock protein 70， HSC70)、热休克蛋白90 (The heat shock protein 90， HSP90)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）的蛋白表达水平及 mRNA 的影响。通过差异表达分析发现结直肠癌患者相对于正常对照样本的LAMP2A表达水平有显著升高，生存分析提示伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）关键分子LAMP2A与结直肠癌的进展密切关联，通过基因集功能富集分析发现LAMP2A高表达患者显著上调了血管生成，免疫抑制等肿瘤进展相关信号通路，且免疫浸润分析发现LAMP2A高表达患者其肿瘤微环境会有更少的CD8T细胞的浸润。仙鹤草-黄连含药血清可以抑制HT29和HCT116细胞活力，最佳干预质量分数及时间为20%、48 h。与NC组相比，仙鹤草-黄连药对均可抑制HT29和HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，药对处理干扰LAMP2A组均能进一步抑制肠癌细胞增殖、侵袭及迁移能力并促进凋亡，而过表达LAMP2A可逆转含药血清处理后结直肠癌细胞被抑制的增殖、迁移、侵袭能力，减少细胞凋亡率。仙鹤草-黄连药对含药血清对CMA具有抑制作用，通过LAMP2A介导的自噬，上调LAMP2A、 HSC70、HSP90蛋白和基因的表达，下调底物蛋白GAPDH的表达发挥抗CRC功能。综上，仙鹤草-黄连药对可通过下调CMA关键分子蛋白LAMP2A表达，抑制CMA活性，从而抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡。

关键词：仙鹤草-黄连药对结直肠癌 LAMP2A 分子伴侣介导自噬

青藤碱抑制PDGF/PDGFR信号通路在NETs诱导RA-FLS迁移作用中的机制研究

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中国中药杂志 2024年第7期49卷 1947-1955页

作者：张永强丁从珠孙玥南京中医药大学鼓楼临床医学院风湿免疫科江苏南京210008

探究青藤碱抑制血小板衍生生长因子/血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor/platelet-derived growth factor receptor,PDGF/PDGFR)信号通路在中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)诱导类风湿关节炎-成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)迁移作用中的相关机制。从3例RA患者滑膜组织中分离培养RA-FLS;从4例RA患者和4名健康体检者(healthy control,HC)外周静脉血中提取NETs。RA-FLS分为对照组、HC-NETs组、RA-NETs组、RA-NETs+青藤碱组、RA-NETs+青藤碱+CP-673451组,通过RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析HC-NETs组、RA-NETs组细胞差异表达基因,使用在线工具Sangerbox数据库进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,使用AutoDock Vina、PyMOL软件对青藤碱与PDGFβ、PDGFRβ作用靶点进行分子对接。通过cell counting kit-8(CCK-8)、划痕实验检测各组RA-FLS增殖和迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PDGFRβ蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)相关基因表达。结果显示,RA患者中性粒细胞更易产生NETs。与HC-NETs组相比,RA-NETs组PDGFβ、PDGFRβ表达上调;与对照组相比,RA-NETs组细胞增殖能力,细胞迁移率,PDGFRβ蛋白,PDGFβ、PDGFRβ、MMP1、MMP3、MMP9 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与RA-NETs组相比,RA-NETs+青藤碱组细胞增殖能力、细胞迁移率、PDGFRβ蛋白与mRNA表达水平,及MMP1、MMP3、MMP9 mRNA表达水平均降低(P<0.05)。与RA-NETs+青藤碱组相比,RA-NETs+青藤碱+CP-673451组细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结果显示,青藤碱通过抑制PDGF/PDGFR信号通路降低RA-NETs诱导RA-FLS迁移能力,实现对RA的缓解效果。

关键词：类风湿关节炎青藤碱 PDGF/PDGFR信号通路中性粒细胞胞外诱捕网成纤维样滑膜细胞

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膝痹宁Ⅱ联合脂肪干细胞外泌体调控线粒体自噬改善膝骨关节炎的机制

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中国实验方剂学杂志 2024年第11期30卷 111-119页

作者：康俊峰揭立士伏厚宇廖太阳施蕾苏子珊于利凯魏义保刘德仁田地茆军王培民南京中医药大学附属医院南京210004 山西中医药大学附属医院太原030024 南京中医药大学第一临床医学院南京210023

目的:观察膝痹宁Ⅱ及脂肪干细胞外泌体(ADSC-Exos)单独及联合应用对软骨退变及线粒体自噬的影响,探讨其改善膝骨关节炎(KOA)的作用机制。方法:将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、ADSC-Exos组(4×10^(8)个/周)、膝痹宁组(8 g·kg^(-1)·... 详细信息

目的:观察膝痹宁Ⅱ及脂肪干细胞外泌体(ADSC-Exos)单独及联合应用对软骨退变及线粒体自噬的影响,探讨其改善膝骨关节炎(KOA)的作用机制。方法:将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、ADSC-Exos组(4×10^(8)个/周)、膝痹宁组(8 g·kg^(-1)·d^(-1))和ADSC-Exos(4×10^(8)个/周)+膝痹宁(8 g·kg^(-1)·d^(-1))组。采用用前交叉韧带切断术(ACLT)建立膝骨关节炎模型。评估大鼠痛敏状态、微计算机断层扫描技术(Micro-CT)及病理染色检测膝关节及软骨组织退变程度、免疫荧光观察p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)B表达情况、酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-15水平、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、含血小板结合蛋白基序的解聚素金属5(ADAMTS5)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、软骨蛋白聚糖抗体(ACAN)、PTEN诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)、p62、LC3A/B蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠冷刺激缩足阈值及机械痛敏阈值逐渐下降,软骨组织出现不同程度的磨损及缺失,软骨组织退变,血清IL-1β、IL-6、IL-15和TNF-α含量明显升高(P<0.01),软骨组织中MMP-3、MMP-13和ADAMTS5蛋白表达升高,ColⅡ、TIMP1和ACAN蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠冷刺激缩足阈值及机械痛敏阈值升高,软骨组织退变程度减轻,血清IL-1β、IL-6、IL-15和TNF-α含量降低(P<0.05,P<0.01),软骨组织中MMP-3、MMP-13和ADAMTS5蛋白表达降低,ColⅡ、TIMP1和ACAN蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);且以Exos+膝痹宁组改变最为明显。结论:ADSCs-Exos及膝痹宁Ⅱ均可以通过促进PINK1/Parkin信号通路表达,提高软骨细胞线粒体自噬水平,延缓软骨组织退变,且二者联用可以增强疗效。

关键词：脂肪干细胞外泌体膝痹宁Ⅱ 线粒体自噬软骨退变膝骨关节炎

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“异类相制”理论及其指导下的有毒中药应用策略

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中医杂志 2024年第5期65卷 449-454页

作者：周学平冯哲俞志超聂炜珏南京中医药大学第一临床医学院江苏省南京市210023 南京中医药大学中医学院

有毒中药功专效捷,其安全应用已成为临床亟待解决的难题,而配伍减毒是有毒中药临床合理应用、发挥其疗效优势的重要方法。“异类相制”理论形成于长期的临床实践认知,是临床经验的提炼升华,其含义为有毒中药通过与不同性味、不同功效中... 详细信息

有毒中药功专效捷,其安全应用已成为临床亟待解决的难题,而配伍减毒是有毒中药临床合理应用、发挥其疗效优势的重要方法。“异类相制”理论形成于长期的临床实践认知,是临床经验的提炼升华,其含义为有毒中药通过与不同性味、不同功效中药的合理配伍,以调其偏性、制其毒性。“异类相制”理论涵盖了性味相制、异效相制、扶正制毒的配伍减毒方式及交互相呈关系,各药物配伍所起的相反相成作用是其内涵的延伸,可从物质基础、效应机制两方面阐释其原理。在此理论指导下,能够优化有毒中药复方配伍方法,为临床有毒中药的配伍组方提供新策略,实现复方的减毒增效。

关键词：异类相制有毒中药配伍减毒组方策略

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扶正解毒颗粒成型工艺优化

中成药 2024年第8期46卷 2726-2731页

作者：朱亚苹邵孟其刘玉鑫吴磊张芹南京中医药大学附属医院南京中医药大学第一临床医学院江苏南京210029

目的优化扶正解毒颗粒成型工艺。方法在单因素试验、Plackett-Burman试验基础上,以辅料比、乙醇体积分数、粘合剂质量分数、乙醇用量、干燥时间、干燥温度为影响因素,成型率、休止角、溶化率、吸湿率的综合评分为评价指标,G1-熵权法结合... 详细信息

目的优化扶正解毒颗粒成型工艺。方法在单因素试验、Plackett-Burman试验基础上,以辅料比、乙醇体积分数、粘合剂质量分数、乙醇用量、干燥时间、干燥温度为影响因素,成型率、休止角、溶化率、吸湿率的综合评分为评价指标,G1-熵权法结合Box-Behnken响应面法优化扶正解毒颗粒成型工艺。结果最佳条件为辅料比(糊精与乳糖)1∶2,润湿剂70%乙醇(含1.4%HPMC),45℃干燥60 min,综合评分为97.61分。结论该方法稳定可行,操作简便,可用于扶正解毒颗粒的后续放大生产。

关键词：扶正解毒颗粒成型工艺 Plackett-Burman设计 G1-熵权法 Box-Behnken响应面法

加味柴胡疏肝散基准样品HPLC指纹图谱及关键质量属性量值传递规律研究

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中草药 2024年第1期55卷 85-100页

作者：姜艳雯邹恺平陈梦娇刘顺江志伟曹园龚冠闻南京中医药大学附属医院江苏省中医院江苏南京210000 南京中医药大学第一临床医学院江苏南京210000

目的建立加味柴胡疏肝散(Modified Chaihu Shugan Powder,MCSP)基准样品HPLC指纹图谱及多成分含量测定的方法,结合化学模式分析,探究关键质量属性的传递规律。方法制备40批MCSP样品,利用HPLC法,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,采用“中... 详细信息

目的建立加味柴胡疏肝散(Modified Chaihu Shugan Powder,MCSP)基准样品HPLC指纹图谱及多成分含量测定的方法,结合化学模式分析,探究关键质量属性的传递规律。方法制备40批MCSP样品,利用HPLC法,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)”计算其相似度,结合化学计量法分析多产地多批次MCSP基准样品,结合指标性成分含量以及转移率,进行量值传递分析及整体质量研究。结果建立的40批MCSP基准样品相似度大于0.90,指纹图谱相似度良好,29个共有峰中指认出其中13个色谱峰,所建立的多成分含量测定方法稳定可靠。芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、新橙皮苷、去氢木香内酯、柴胡皂苷A的平均转移率分别为29.96%、22.08%、32.98%、22.42%、33.26%、15.50%、34.23%、56.94%、8.66%、8.69%。结论采用指纹图谱结合多指标成分含量测定及转移率等评价指标对MCSP基准样品进行了量值传递综合考察,初步构建MCSP全过程质量控制体系,为制剂开发及MCSP的进一步研究提供参考。

关键词：加味柴胡疏肝散基准样品指纹图谱因子分析量值传递关键质量属性芍药内酯苷芍药苷阿魏酸芸香柚皮苷柚皮苷橙皮苷橙皮素新橙皮苷去氢木香内酯柴胡皂苷A