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非洲马瘟病毒VP7蛋白的可溶性表达及抗体阻断ELISA方法的初步建立

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中国兽医科学 2024年第10期 1318-1326页

作者：徐婧户鑫兵宋昱庆张鸿歌田占成关贵全罗建勋殷宏魏衍全独军政甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为了实现非洲马瘟病毒（AHSV）VP7蛋白的可溶性表达，制备其特异性单克隆抗体，建立AHSV VP7阻断ELISA抗体检测方法，通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化，以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化，免疫... 详细信息

为了实现非洲马瘟病毒（AHSV）VP7蛋白的可溶性表达，制备其特异性单克隆抗体，建立AHSV VP7阻断ELISA抗体检测方法，通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化，以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得VP7蛋白单克隆抗体。通过细胞免疫荧光和Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性，并建立AHSV VP7阻断ELISA方法。结果显示，利用大肠杆菌表达系统成功表达了可溶性重组AHSV VP7蛋白，将纯化的VP7蛋白免疫小鼠筛选制备了2株稳定分泌VP7蛋白单克隆抗体的细胞株，分别为3F7和7H8。经鉴定证明这2株VP7单克隆抗体不仅能与大肠杆菌重组表达的VP7蛋白反应，而且也与BHK-21细胞表达的具有天然构象的重组VP7蛋白反应，具有良好的特异性和反应性。以重组VP7蛋白和单克隆抗体7H8分别为包被抗原和阻断抗体建立了AHSV VP7阻断ELISA方法，检测了277份马血清样本，结果与商品化进口AHSV抗体检测试剂盒测定结果一致。本研究在大肠杆菌表达系统中实现了AHSV VP7蛋白的可溶性表达，制备获得了VP7特异性单克隆抗体，并建立了AHSV VP7阻断ELISA方法，为我国有效防控非洲马瘟的传入提供了技术储备。

关键词：非洲马瘟病毒 VP7蛋白可溶性表达单克隆抗体阻断ELISA

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甘肃某羊场绵羊流产衣原体的分离鉴定

中国兽医科学 2024年

作者：李赟辉李韦张淮瑜金有顺赵鹏善王彦俨王一晗肖乾李兆才许信刚西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃元生农牧科技有限公司

为确定导致甘肃省某绵羊养殖场妊娠母羊流产的病原，笔者采集流产母羊的血清和胎水样本，采用ELISA、荧光PCR以及16S rRNA和ompA基因扩增测序，进行流产相关病原检测，并对阳性样本进行病原分离鉴定。结果显示，20份血清流产衣原体抗体... 详细信息

为确定导致甘肃省某绵羊养殖场妊娠母羊流产的病原，笔者采集流产母羊的血清和胎水样本，采用ELISA、荧光PCR以及16S rRNA和ompA基因扩增测序，进行流产相关病原检测，并对阳性样本进行病原分离鉴定。结果显示，20份血清流产衣原体抗体均为阳性，而布鲁氏菌抗体和贝氏柯克斯体抗体均为阴性。5份胎水中仅检出流产衣原体特异性核酸。流产衣原体阳性胎水接种SPF鸡胚，成功分离到1株衣原体，经16S rRNA和ompA基因测序、包涵体观察和免疫荧光染色，鉴定分离株为流产衣原体。鸡胚半数致死量试验显示，0.4 mL流产衣原体分离菌株的ELD50为10-7.55，表明分离株对鸡胚的毒力较强。结果表明，引起该绵羊养殖场妊娠绵羊流产的病原为流产衣原体，并成功分离到流产衣原体流行菌株，为绵羊流产衣原体病的流行病学和防制提供了参考。

关键词：流产衣原体分离鉴定 PCR 免疫荧光染色绵羊

NRF2激动剂衣康酸4-辛酯对猪伪狂犬病病毒的抑制作用研究

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中国兽医科学 2024年

作者：方春艳杨发誉朱紫祥郑海学包世俊魏衍全张石磊甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为筛选高效抑制猪伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，PRV）的小分子抑制剂，首先利用流式细胞分析技术结合小分子药物库筛选出对PRV具有高效抑制活性的小分子药物，并利用CCK-8法检测其对PK15细胞活力的影响。其次，利用Western-blot检... 详细信息

为筛选高效抑制猪伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，PRV）的小分子抑制剂，首先利用流式细胞分析技术结合小分子药物库筛选出对PRV具有高效抑制活性的小分子药物，并利用CCK-8法检测其对PK15细胞活力的影响。其次，利用Western-blot检测PRVgB蛋白、TCID50测定PRV滴度等方法检测小分子药物对PRV的抑制作用。最后，利用Western-blot检测小分子药物抑制PRV生命周期的具体阶段。结果显示，流式细胞术分析筛选出的对PRV抑制最明显的3种小分子药物中，CyanosafracinB、Staurosporine对PK15细胞有很强的细胞毒性，而衣康酸4-辛酯（4-OI）在300μmol/L的浓度下对PK15细胞基本无毒性。4-OI对不同MOI的PRV均表现出较强的抑制作用，表现为PRV子代病毒滴度的降低、PRVgB蛋白的表达水平下降，并呈剂量依赖性。4-OI及其靶蛋白Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2（NRF2）能够抑制PRV在细胞内的复制，而不影响PRV吸附PK15细胞及其内化过程。本研究表明4-OI是一种潜在的高效抑制PRV的小分子药物，为PRV防控提供了新的参考依据。

关键词：药物筛选衣康酸4-辛酯(4-OI) 猪伪狂犬病病毒(PRV) 抗病毒作用

嵌合流行毒株G-H环基因重组口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2024年

作者：李平花黄书伦张克强刘锋孙普李冬包慧芳曹轶梅白兴文马雪青李坤袁红刘在新卢曾军中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）的疫苗候选株，本研究利用FMDV反向遗传操作技术，通过基因替换，构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克... 详细信息

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）的疫苗候选株，本研究利用FMDV反向遗传操作技术，通过基因替换，构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆，转染表达T7RNA聚合酶的细胞后拯救重组FMDV，分析结构蛋白基因的重构对病毒生物学特性的影响；拯救病毒制备灭活疫苗，免疫猪和牛，用体外中和试验初步研究其做为O型FMD疫苗候选株的潜力。结果表明FMD流行毒株结构蛋白VP1 G-H环基因的替换没有明显影响重组病毒的噬斑表型和复制能力，但不同FMDV G-H环抗原表位对猪诱导机体产生交叉中和抗体水平影响较大，对牛诱导机体产生交叉中和抗体的影响较小，表明FMDV G-H抗原表位是猪免疫优势的表位。本研究为未来FMDV疫苗的设计提供了重要参考。

关键词： G-H环重组口蹄疫病毒拯救免疫原性分析

饲粮中添加不同水平钙磷对断奶仔猪肠道微生物和肠道上皮屏障功能的影响

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动物营养学报 2024年

作者：苗振彦李英孙焱杰吴绮雯邓东艳唐佳希杨雪芬王丽蒋宗勇易宏波广东省农业科学院动物科学研究所猪禽种业全国重点实验室农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心华南农业大学兽医学院

本试验旨在探讨饲粮中添加不同水平钙磷对断奶仔猪肠道微生物和肠道上皮屏障功能的影响。144头断奶仔猪(杜×长×大,21日龄)随机分配到6个组,每组6个栏,每栏4头(公母各占1/2)。饲粮标准全消化道可消化钙(STTD Ca)和标准全消化道可消化磷... 详细信息

本试验旨在探讨饲粮中添加不同水平钙磷对断奶仔猪肠道微生物和肠道上皮屏障功能的影响。144头断奶仔猪(杜×长×大,21日龄)随机分配到6个组,每组6个栏,每栏4头(公母各占1/2)。饲粮标准全消化道可消化钙(STTD Ca)和标准全消化道可消化磷(STTD P)比值固定为1.2,6个组(CAP1～6组)STTD Ca含量分别为0.216%、0.312%、0.408%、0.504%、0.600%、0.696%,对应的STTD P含量分别为0.18%、0.26%、0.34%、0.42%、0.50%、0.58%。试验期为42 d。结果表明:1)与CAP1组和CAP6组相比,CAP2组和CAP4组仔猪结肠微生物Chao1指数显著降低(P<0.05),Goods＿coverage指数显著提高(P<0.05)。与CAP1组相比,CAP5组仔猪结肠中变形菌门(Proteobacteria)、狭义梭菌属1(Clostridium＿sensu＿stricto＿1)相对丰度显著增加(P<0.05),拟杆菌门(Bacteroidota)、粪杆菌属(Faecalibacterium)的相对丰度显著降低(P<0.05);而CAP6组链球菌属(Streptococcus)、粪杆菌属的相对丰度显著降低(P<0.05),克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae＿R-7＿group)的相对丰度显著增加(P<0.05)。2)CAP6组仔猪结肠内容物中乙酸含量最低,且显著低于CAP1组(P<0.05);同时,CAP1组仔猪结肠内容物中异丁酸和异戊酸含量显著低于其他5组(P<0.05),且相关性分析揭示异丁酸和异戊酸的含量变化与狭义梭菌属1、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)等微生物相对丰度密切相关。3)与CAP1组相比,CAP6组仔猪空肠闭锁蛋白-1(Claudin-1)基因相对表达量和蛋白表达水平降低,且回肠闭合蛋白(Occludin)和Claudin-1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05);同时,CAP4组仔猪回肠Occludin基因相对表达量和空肠Claudin-1的蛋白表达水平显著低于CAP1组(P<0.05);此外,与CAP4组相比,CAP6组回肠Occludin和空肠Claudin-1的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。综上可知,饲粮中添加不同水平钙磷对仔猪肠道微生物及其肠道屏障功能具有重要调控作用,且0.504%STTD Ca和0.42%STTD P有利于维护肠道微生物稳态和肠道上皮屏障功能,而低钙磷(0.216%STTD Ca和0.18%STTD P)会抑制肠道微生物代谢物的产生,高钙磷(0.696%STTD Ca和0.58%STTD P)可能会损害仔猪肠道上皮屏障功能。

关键词：断奶仔猪钙磷肠道微生物肠道屏障

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口蹄疫病毒非结构蛋白3D的研究进展

中国兽医科学 2024年

作者：翟凤格聂振宇张涵张钊裴晶晶郑海学河南农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种在偶蹄动物间感染与传播的急性、热性、高度传染性疾病，动物死亡率高，严重影响农业生产，造成巨大的经济损失。FMDV 3Dpol蛋白不仅在基因组复制中发挥至关重要的作用，还参与调节宿主... 详细信息

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种在偶蹄动物间感染与传播的急性、热性、高度传染性疾病，动物死亡率高，严重影响农业生产，造成巨大的经济损失。FMDV 3Dpol蛋白不仅在基因组复制中发挥至关重要的作用，还参与调节宿主细胞生物学过程，包括病毒复制复合体的组装和定位以及先天免疫反应。本文对FMDV 3Dpol与宿主的相互作用、抗病毒靶点研究以及病毒检测应用等内容进行了系统综述，旨在为疫病防控提供新思路。

关键词：口蹄疫病毒 3D 宿主病毒相互作用药物靶点

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基于酶促重组酶扩增的非洲猪瘟病毒检测方法

畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4226-4231页

作者：冯露田宏郑海学石正旺罗俊聪张晓阳尉娟娟周静廖焕程王婉莹西北民族大学生命科学与工程学院兰州730000 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件... 详细信息

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。

关键词：非洲猪瘟病毒 ERA 核酸检测等温扩增

长角血蜱Septin-3的原核表达及其免疫分析

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 801-807页

作者：车丽妍王彦龙张振杰刘光远关贵全殷宏任巧云赵爱云王国辉张文霞罗金齐萌塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300 中国农业科学院、兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为探究长角血蜱Septin-3蛋白的结构、生物学功能和免疫特性,通过基因克隆和原核蛋白表达解析Septin-3蛋白的分子结构,利用制备多克隆抗体、ELISA检测抗体效价和Western-blot检测分析Septin-3蛋白的免疫特性,结合动物感染试验验证Septin-... 详细信息

为探究长角血蜱Septin-3蛋白的结构、生物学功能和免疫特性,通过基因克隆和原核蛋白表达解析Septin-3蛋白的分子结构,利用制备多克隆抗体、ELISA检测抗体效价和Western-blot检测分析Septin-3蛋白的免疫特性,结合动物感染试验验证Septin-3蛋白的功能。结果显示,Septin-3基因的目的片段大小为1017 bp,可编码约338个氨基酸残基,表达38 ku大小的蛋白,抗体效价较高,为1∶256000。新西兰大白兔攻蜱试验结果显示,与对照组相比,经重组Septin-3蛋白免疫后长角血蜱的饱血时间增加了1.34 d,饱血后重量下降了20.03~24.75 mg,饱血率下降了11.04%。研究结果提示,重组Septin-3蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,对长角血蜱的生长发育有一定的抑制作用。

关键词：长角血蜱 Septin-3基因原核表达抗体免疫分析

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鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定

中国人兽共患病学报 2024年第9期 823-828页

作者：李兆才刘萍李赟辉张淮瑜肖乾刘春国周继章中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室西北农林科技大学动物医学院山东信得科技股份有限公司集团检测中心兰州大学动物医学与生物安全学院

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏，进行衣原体荧光PCR检测；将阳性样本匀浆和无菌处理后，接种L929细胞，连续传代培养，通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原... 详细信息

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏，进行衣原体荧光PCR检测；将阳性样本匀浆和无菌处理后，接种L929细胞，连续传代培养，通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原体包涵体的形成；提取分离株DNA并测序，分析16S rRNA、16-23S IGS和ompA基因序列进行种属鉴定和基因分型。结果成功分离到1株鸭源鹦鹉热衣原体，基因型鉴定为A型。结论鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定扩大了对A型菌株感染宿主范围的认识，为其生物学特性、致病性和防控技术及公共卫生等相关研究提供基础资料。

关键词：鹦鹉热衣原体细胞培养基因分型鸭