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敲除LTA4H基因的PK-15细胞系构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

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微生物学报 2024年第3期64卷 733-744页

作者：王家丽蒲秀瑛杨帆邵文华黄梦瑶曹伟军郑海学张伟兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。

关键词： CRISPR/Cas9 白三烯A4水解酶细胞系口蹄疫病毒

过表达JMJD6基因的293T细胞系的构建及对水疱性口炎病毒增殖效率的评价

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中国兽医科学 2024年第5期54卷 569-576页

作者：黄梦瑶杨帆杨洋邵文华王家丽吕岳芹赵晓义陈治彤曹伟军张伟郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系与HEK-293T细胞中的复制差异。首先以JMJD6基因为目标,构建重组质粒pLV-puro-3×Flag-JMJD6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达JMJD6基因的阳性细胞。利用Western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术和蚀斑试验检测VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系中的复制能力。结果显示,在HEK-293T/JMJD6细胞系中,VSV的复制能力显著增强。实时荧光定量检测VSV感染的HEK-293T/JMJD6细胞系和野生型HEK-293T细胞中干扰素下游基因的表达,结果显示HEK-293T/JMJD6细胞系抑制VSV诱导的Ⅰ型干扰素下游基因的产生。总之,本研究构建的HEK-293T/JMJD6细胞系能显著促进VSV的增殖并抑制Ⅰ型干扰素信号通路,为VSV疫苗候选细胞株的筛选奠定了基础。

关键词： JMJD6 水疱性口炎病毒慢病毒包装过表达细胞系干扰素

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基于响应面法优化脂质纳米颗粒的配方及表征

中国兽医科学 2024年

作者：麻玉清柳海云郭伟江丽馨孙世琪王晓强马全英郭慧琛兰州交通大学化学化工学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州交通大学生物与制药工程学院

脂质纳米颗粒是目前最有应用前景的药物载体之一，本研究旨在解决原材料配方对脂质纳米颗粒自组装的影响，优化其配方。首先，以包封率为评价指标，通过单因素试验确定膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000的含量。其次，采用Box-Benhnken响... 详细信息

脂质纳米颗粒是目前最有应用前景的药物载体之一，本研究旨在解决原材料配方对脂质纳米颗粒自组装的影响，优化其配方。首先，以包封率为评价指标，通过单因素试验确定膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000的含量。其次，采用Box-Benhnken响应面分析法优化脂质纳米颗粒制备工艺，并对其进行表征评价。结果表明，通过单因素试验确定的三因素分别是：膜材比、脂质浓度和DMG-PEG 2000含量。三因素的三水平分别为：膜材比选择1∶1、2∶1、3∶1，脂质浓度选择15 、20 、25 mmol/L，DMG-PEG2000含量选择5%、7%、9%。通过Box-Benhnken响应面分析法得出：当脂质纳米颗粒的膜材比为2∶1，脂质浓度为20 mmol/L，DMG-PEG2000含量为7%时，其脂质纳米颗粒的包封率为(94.8±0.15)%，粒径(43.77±0.25) nm，聚合物分散指数(polymer dispersity index，PDI)为(0.14±0.04)，Zeta电位(-0.44±0.15) mV。利用透射电镜观察该脂质纳米颗粒的形态为球形结构、分散均匀。稳定性试验显示4 ℃放置28 d后，脂质纳米颗粒的平均粒径、PDI和包封率无显著变化，说明该脂质纳米颗粒稳定性良好。本研究为制备一种高效的脂质纳米颗粒提供参考依据。

关键词：脂质纳米颗粒 Box-Benhnken响应面法单因素包封率

非洲猪瘟病毒I215L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2024年

作者：杜煜孙茂文曹丽艳孔祥雨李想通张宇王琦郑海学兰州理工大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室中国农业科学院都市农业研究所

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒（ASFV）I215L基因编码的泛素结合酶（UBCv1），对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板，成功扩增I215L基因并插入原核表达载体，形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后，... 详细信息

本研究聚焦于非洲猪瘟病毒（ASFV）I215L基因编码的泛素结合酶（UBCv1），对其进行原核系统表达并制备了多克隆抗体。以ASFV CN/GS/2018株为模板，成功扩增I215L基因并插入原核表达载体，形成重组质粒pET28a-I215L。经大量诱导表达后，利用切胶方法成功纯化出重组蛋白。将提纯后的I215L蛋白与佐剂混合对动物进行多次免疫，获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体效价，鼠抗I215L多抗效价达到1∶64 000以上，兔抗I215L多抗效价达到1∶512 000；间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western-blot）结果显示，该多抗具有特异性识别ASFV感染后I215L蛋白的能力，并且显示出良好的效果。本研究在体外表达并纯化了ASFV I215L蛋白，成功获得鼠/兔抗I215L蛋白的多克隆抗体，这为后期ASFV I215L蛋白的结构解析、功能研究及病毒相关致病机制的探索奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 I215L蛋白原核表达多克隆抗体

广东省腹泻仔猪大肠杆菌blaCTX-M-65与mcr-1基因共传播特征

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中国畜牧兽医 2024年第3期51卷 1286-1297页

作者：张岩曹孟涛卢跃溦蒋红霞王令李斌华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室广州510642 广州市动物卫生监督所广州510440 广州市从化区无规定马属动物疫病区管理中心广州510900

【目的】调查分析广东省某生猪养殖场腹泻仔猪的大肠杆菌耐药情况以及同时携带blaCTX-M-65与mcr-1两种耐药基因的阳性大肠杆菌的分子特征与其共同传播特征,为耐药性监测及风险防控提供科学依据。【方法】从广东省肇庆市某生猪养殖场采... 详细信息

【目的】调查分析广东省某生猪养殖场腹泻仔猪的大肠杆菌耐药情况以及同时携带blaCTX-M-65与mcr-1两种耐药基因的阳性大肠杆菌的分子特征与其共同传播特征,为耐药性监测及风险防控提供科学依据。【方法】从广东省肇庆市某生猪养殖场采集腹泻仔猪直肠棉拭子样品90份,并进行大肠杆菌分离鉴定;采用PCR方法检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与mcr-1基因,通过测序确定CTX-M亚型;采用琼脂二倍稀释法和微量肉汤稀释法测定分离菌对12种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC);使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点序列分型(MLST)分析菌株间的遗传背景;通过接合转移方法确定质粒水平转移的能力;使用复制子分型、S1-PFGE、Southern blotting方法检测质粒类型、耐药基因的定位及定位质粒的大小;通过三代测序及序列分析确定质粒的重组过程。【结果】共分离鉴定86株大肠杆菌,检测到44株携带CTX-M型ESBLs基因,其中blaCTX-M-55基因最流行(n=16,36.4%),其次是blaCTX-M-65(n=10,22.7%)、blaCTX-M-27(n=8,18.2%)、blaCTX-M-15(n=5,11.4%),还检测出blaCTX-M-79(n=2,4.5%)、blaCTX-M-14(n=2,4.5%)和blaCTX-M-24(n=1,2.3%)。10株blaCTX-M-65基因阳性菌有8株同时携带mcr-1基因。这8株大肠杆菌均表现为多药耐药,包括氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、头孢喹肟、黏菌素等多种抗生素。8株菌共分为6种ST型、7个PFGE谱型。接合转移试验发现,有6株菌的blaCTX-M-65和mcr-1基因发生了共转移,且blaCTX-M-65与mcr-1基因均位于IncHI2型(253 kb)质粒上。其中1株菌在接合转移的过程中,其所携带的一个253 kb IncHI2质粒与一个69 kb IncFⅡ质粒发生融合,形成一个大小323 kb的融合质粒。对融合质粒进行三代测序解析,结果表明,在接合转移的过程中IS26介导了两个不同大小质粒的重组。【结论】IncHI2质粒是介导blaCTX-M-65和mcr-1基因共同传播的主要媒介,IS26通过与靶位点GTTTCACT的整合导致IncHI2质粒与IncFⅡ质粒融合。质粒重组扩大了大肠杆菌的耐药谱,加速了耐药基因的传播,促使多药耐药现象更严重,对公共卫生安全构成威胁,本研究为阐明多重耐药大肠杆菌的传播机制提供了参考依据。

关键词：大肠杆菌 blaCTX-M-65 mcr-1 IS26 质粒融合

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绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1728-1737页

作者：杜改梅王月茅慧华雷卫强储岳峰刘茂军金陵科技学院动物科学与食品工程学院南京210038 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院/动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μ... 详细信息

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

关键词：绵羊肺炎支原体小鼠感染模型

信鸽产酸克雷伯菌GS-BY-GG的分离鉴定

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中国人兽共患病学报 2024年第6期40卷 512-519页

作者：李韦李赟辉金有顺巴旭丽张淮瑜韩涛李兆才周继章中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 西安乡下人有限公司蓝田710500 甘肃省病原生物学基础学科研究中心兰州730046

目的分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病... 详细信息

目的分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行耐药性和致病性研究。结果病鸽肝、肺、心等多器官出血,肝脏发黄且质地脆,肺脏发生化脓;从病鸽中成功分离到一株革兰氏阴性、短杆状菌株,麦康凯琼脂培养基上为粉红色光滑、湿润、圆形菌落,靛基质试验阳性;16S rRNA扩增序列与MN330093.1同源性达100.00%,表明病鸽感染产酸克雷伯菌,并命名为GS-BY-GG;产酸克雷伯菌GS-BY-GG对青霉素、氨苄西林和呋喃唑酮等10种药物耐药,对氟苯尼考、美罗培南和庆大霉素等5种药物敏感;组织病理学观察可见病鸽多器官出血,肝脏细胞排列不规则、多处可见棕黄色色素沉积,气管黏膜上皮广泛细胞坏死和脱落、黏膜层可见大量炎性细胞浸润;接种SPF雏鸡显示分离菌具有很强的致病性。结论本研究成功分离了鸽源产酸克雷伯菌GS-BY-GG,研究结果为产酸克雷伯的临床诊断和防治提供数据支撑。

关键词：产酸克雷伯菌信鸽分离鉴定耐药情况组织病理学

猫疱疹病毒1型病毒样颗粒在酵母中的制备及体外组装

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 866-872页

作者：赵梦杉吕熙王运航裴辰辰刘艺佳郭慧琛孙世琪杨丰利董虎长江大学动物科学技术学院湖北荆州434025 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 榆林学院生命科学学院陕西榆林719000

为研发猫疱疹病毒1型(FHV-1)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,将FHV-1 g D基因和自组装蛋白I301基因序列融合后克隆到pPink-HC载体中,由毕赤酵母表达重组g D蛋白。随后观察不同pH对蛋白质表达和VLPs组装效果的影响。结果显示,经SDS-PAGE和Western-... 详细信息

为研发猫疱疹病毒1型(FHV-1)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,将FHV-1 g D基因和自组装蛋白I301基因序列融合后克隆到pPink-HC载体中,由毕赤酵母表达重组g D蛋白。随后观察不同pH对蛋白质表达和VLPs组装效果的影响。结果显示,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,发现培养基pH3.0条件下毕赤酵母表达出了完整的重组g D蛋白,而pH6.0条件下表达的蛋白分子质量小于预计大小;另外,组装液pH8.0时VLPs的组装效果优于pH6.0、7.0。结果表明,酸性环境可有效抑制毕赤酵母内蛋白酶对重组g D蛋白的水解作用,重组g D蛋白可在弱碱性环境中利用自组装蛋白I301在体外完成组装,为FHV-1 VLPs疫苗制备奠定了基础。

关键词：猫疱疹病毒1型病毒样颗粒酵母表达系统 g D基因

核糖体相关质量控制在精微调控蛋白质合成中的作用机制及意义

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微生物学通报 2024年第8期51卷 2741-2752页

作者：高明阳杨宣叶吴玉湖王进千胡欣妍尚佑军马忠仁马晓霞西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃兰州730030 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730010 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

蛋白质是细胞发挥其生物学活性的基石,细胞的活动及其稳态对生命体发生发展至关重要。为了生存繁衍,生命体已经进化出多种应对内、外源性刺激的调控机制以适应各种环境的变化。在诸多适应性调节机制中,核糖体相关质量控制已成为维持蛋... 详细信息

蛋白质是细胞发挥其生物学活性的基石,细胞的活动及其稳态对生命体发生发展至关重要。为了生存繁衍,生命体已经进化出多种应对内、外源性刺激的调控机制以适应各种环境的变化。在诸多适应性调节机制中,核糖体相关质量控制已成为维持蛋白质稳态、确保细胞正常生理活动不可或缺的部分。目前对核糖体的研究已不仅仅局限于基因表达方面,而是更加聚焦于核糖体对蛋白合成异常的监测及控制异常蛋白对细胞稳态的影响。这些新的关注点就包含抗病毒机制、神经退行性疾病及癌症等方面。因此,本文旨在通过对核糖体相关质量控制的分子机制及其失调所导致的不良后果等进行综述,为相关研究人员在研究蛋白质合成降解以及相关疾病时提供思路和见解。

关键词：核糖体相关质量控制蛋白质生命活动细胞稳态疾病