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猪δ冠状病毒与猪流行性腹泻病毒的受体结合区融合表达及免疫原性分析

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2150-2161页

作者：仝力心芦延珍于瑞明张莉萍刘霞王永录杜晓华刘新生甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为了研发出一种可同时预防猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCo V)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)两种病毒病的有效二联亚单位疫苗,本研究将PDCo V的受体结合域(receptor binding domain,RBD)与PEDV的RBD基因进行串联,构建至真核表达载体p CDNA3.1(+)中,利用哺乳动物细胞Expi CHO^(TM)表达系统表达纯化出PDCo V-RBD-PEDV-RBD(简写为pd RBD-pe RBD)融合蛋白,以3种不同剂量(10、20和30μg)免疫小鼠,利用ELISA和流式细胞术评估该融合蛋白诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应,利用病毒微量中和试验测定免疫小鼠血清对PDCo V或PEDV的中和效价。结果表明,3个不同剂量组在加强免疫后均诱发了高水平的Ig G抗体,不同剂量组间抗体水平没有明显差异,说明10μg的免疫剂量即可达到较好免疫效果。流式细胞术检测结果显示,免疫组的CD3^(+)CD4^(+)T细胞比例显著升高,CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例相对较低,这符合亚单位疫苗主导机体产生体液免疫反应的预期。同时,对血清中细胞因子白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的含量进行了检测,结果表明该融合蛋白诱导了良好的体液免疫效果,同时还产生了一定的细胞免疫应答。中和试验结果表明,10μg免疫剂量所诱导的抗体即可在体外有效中和PDCo V和PEDV两种病毒,效价分别为1:179.25和1:141.21。上述研究结果表明,pd RBD-pe RBD融合蛋白10μg免疫剂量即可诱导高水平的体液免疫反应,诱导的抗体可同时中和PDCo V和PEDV两种病毒,说明pd RBD-pe RBD融合蛋白有希望成为一种能同时预防PDCo V和PEDV的有效二联亚单位疫苗。

关键词：猪德尔塔冠状病毒猪流行性腹泻病毒受体结构域亚单位疫苗

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PEDV非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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微生物学报 2024年

作者：涂赟于瑞明张莉萍王永录潘丽刘霞杜晓华刘新生甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒，PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失，目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白，其存... 详细信息

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒，PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失，目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白，其存在相互作用的宿主蛋白尚不清楚。【目的】筛选与PEDV Nsp8互作宿主蛋白，初步探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响，为寻找PEDV新的关键性治疗靶点提供理论基础。【方法】利用真核表达载体pcDNA3.1（+）成功构建PEDV Nsp8真核表达质粒，通过免疫共沉淀、质谱分析及激光共聚焦等技术筛选能够与其相互作用的宿主蛋白，进一步在LLC-PK细胞中通过过表达、敲低等方法探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响。【结果】质谱检测筛选到Nsp8潜在互作宿主蛋白36个，验证了宿主蛋白热休克蛋白成员8 （heat shock protein member 8， HSPA8）与Nsp8相互作用，在LLC-PK细胞中过表达HSPA8能够剂量依赖性抑制Nsp8蛋白过表达，而且在蛋白质和转录水平显著剂量依赖性抑制PEDV复制；干扰内源性HSPA8表达能够显著促进PEDV复制，TCID50和间接免疫荧光试验检测（indirect immunofluorescent assay， IFA）结果进一步证明了HSPA8抑制PEDV复制。【结论】本研究筛选出PEDV Nsp8的互作宿主蛋白HSPA8，并且证明HSPA8能显著抑制PEDV复制，为设计以HSPA8为靶点的预防或治疗药物提供新思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒 Nsp8 免疫共沉淀技术 HSPA8

口蹄疫病毒与塞内卡病毒灭活抗原免疫小鼠脾脏的转录组学差异分析

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生物工程学报 2024年

作者：郑紫萱马雪青李坤孙普黄书伦董开恒赵琼琼卢曾军钱平华中农业大学动物医学院农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室

本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）与塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠... 详细信息

本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）与塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠，设置PBS免疫对照组；利用流式细胞术分析免疫后14、28 d各组小鼠脾淋巴细胞中Th1与Th2细胞的比例，并进行小鼠脾脏转录组测序和分析；通过体外抗原刺激鼠巨噬细胞验证筛选差异基因的表达。结果显示，小鼠免疫后14 d，FMDV与SVA抗原免疫组诱导Th1/Th2型免疫应答水平无显著差异，免疫后28 d，SVA抗原免疫组诱导Th1型与Th2型免疫应答水平均高于FMDV抗原免疫组；转录组测序获得2种抗原免疫后2组共有差异基因Rsad2和Tspan8等，可能参与FMDV和SVA抗原激活Th1/Th2型免疫应答反应的过程；FMDV与SVA抗原体外刺激巨噬细胞分泌IL-12、IL-33，差异基因Tspan8、Rsad2的表达趋势同转录组测序结果一致，Rsad2的表达受I型干扰素（IFNα、IFNβ）的调控。本研究获得小鼠脾脏中2种抗原免疫应答相关差异基因，为进一步研究FMDV和SVA免疫应答机制奠定重要的分子基础。

关键词：口蹄疫病毒 A型塞内卡病毒 Th1/Th2型免疫应答脾脏转录组测序

赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1548-1558页

作者：林永玉石正旺罗俊聪朱昱茜席韬周静张帆石鑫泰王川田宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enz... 详细信息

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

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羊捻转血矛线虫病检测方法研究进展

畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1499-1510页

作者：张少华王帅邹扬刘仲藜才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

羊捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫寄生于羊等小反刍动物皱胃内引起的一种危害严重的嗜血性寄生虫病。病羊临床表现为消瘦、贫血和衰弱等慢性消耗性症状,严重感染者可致死。该病在我国牧区普遍流行,目前暂无安全长效疫苗可用,加之耐药... 详细信息

羊捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫寄生于羊等小反刍动物皱胃内引起的一种危害严重的嗜血性寄生虫病。病羊临床表现为消瘦、贫血和衰弱等慢性消耗性症状,严重感染者可致死。该病在我国牧区普遍流行,目前暂无安全长效疫苗可用,加之耐药性严重,放牧羊群感染率和发病率居高不下,极大地降低了羊养殖业的经济效益。准确可靠的检测手段是诊断寄生虫感染、制定驱虫治疗方案、耐药监测及流行病学调查的关键环节。本文详细介绍了羊捻转血矛线虫病的检测技术研究现状,分析了病原学、免疫学及分子检测等方法的优缺点,并对未来检测技术发展趋势进行了展望,以期为该病新型检测方法的研发及综合防控策略提供参考。

关键词：羊捻转血矛线虫病原学检测免疫学检测分子检测

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偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒制备及免疫原性评价

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生物工程学报 2024年

作者：张越茹毅郝荣增杨洋赵陇和李亚军杨锐卢炳州郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和Spytag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码S... 详细信息

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和Spytag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码Spycatcher与铁蛋白的基因序列融合后插入pET-28a（+）载体，得到pET-F-np质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达。然后，将亲和层析纯化后的p30蛋白与铁蛋白在体外偶联结合，用分子筛纯化后得到偶联p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p30，利用粒径仪、透射电镜观察形态结构。将F-p30纳米颗粒蛋白免疫小鼠，评估其体液和细胞免疫应答。试验结果表明，本研究成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，颗粒结构约20 nm。F-p30在体外能被小鼠骨髓源树突状细胞（bone marrow derived cells， BMDC）高效摄取，与p30蛋白相比， F-p30纳米颗粒免疫小鼠诱导产生更高水平的特异性抗体和细胞因子，更有利于刺激淋巴结滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell， TFH)、生发中心B细胞（germinal center B cells， GCB）和脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖。综上，本研究成功制备了偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，能显著增强p30蛋白的免疫原性，有助于非洲猪瘟疫苗的研究。

关键词：非洲猪瘟 p30蛋白铁蛋白纳米颗粒免疫原性

O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒单抗制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

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畜牧兽医学报 2024年

作者：廖焕程石正旺罗俊聪王婉莹冯露周静张帆石鑫泰田宏中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原，并制备单克隆抗体，为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛... 详细信息

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原，并制备单克隆抗体，为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛选阳性细胞，有限稀释法进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌特异性针对O型口蹄疫Cathay株病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为10E6与11C7。叠加试验表明，两株单抗的叠加率为49.45%，识别不同的抗原表位。间接ELISA和IFA试验显示，两株单抗与O型口蹄疫Cathay株病毒具有良好的反应性。单抗特异性检测结果表明，2株单抗均能特异性识别Cathay株口蹄疫病毒，不与其他口蹄疫病毒毒株交叉反应。抗体亚型鉴定结果显示，10E6单抗的轻链为Kappa链、11C7单抗的轻链为Lamda链，两株单抗重链类型均为IgG2a。结果表明，本研究成功制备了两株特异性结合O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒的单克隆抗体，两株单抗均具有良好的反应性与特异性。应用两株单抗建立O型口蹄疫Cathay病毒的双抗体夹心ELISA检测方法，该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好，为O型口蹄疫Cathay毒株的快速诊断防控与研究建立了基础。

关键词： O型口蹄疫病毒 Cathay拓扑型杂交瘤细胞单克隆抗体 ELISA

山羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定及其毒力评价

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黑龙江畜牧兽医 2024年第10期 65-70,114,115页

作者：崔宁党光辉鹿萍郭若男姜艳艳陈凡若刘思国新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室哈尔滨150069

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评... 详细信息

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评价。结果表明:共得到3株分离株,其菌落形态和生化特性菌与伪结核棒状杆菌相符,分别命名为CP045、CP073、CP969;分离株CP045、CP073、CP969的16S rDNA基因序列与伪结核棒状杆菌参考株的相似性分别高达98.8%、100%、99.8%,进一步确定3株分离株均为伪结核棒状杆菌。注射分离株CP073的3只小鼠中有2只于注射后36~48 h陆续死亡,1只精神极度沉郁、食欲不振;注射分离株CP045、CP969的3只小鼠于注射后5 d内均未见死亡,但状态不佳。注射分离株CP045、CP073、CP969的小鼠肝脏均不同程度出血、肿大,脾脏轻微出血;注射分离株CP073的小鼠皮肤表面有黄色脓汁渗出,皮下有黄白色玉米粒大小的结核样脓肿;注射分离株CP045和CP969的小鼠皮下未见明显脓肿。说明该山羊养殖场疑似患有伪结核病的病羊感染了伪结核棒状杆菌,分离到的3株伪结核棒状杆菌毒力不同,其中分离株CP073可引起小鼠死亡,毒力较分离株CP045、CP969强。

关键词：伪结核棒状杆菌伪结核病分离鉴定 16S rDNA 致病性试验生化鉴定

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基于碳水化合物的佐剂作用机制研究进展

畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 491-501页

作者：周梦婷宋银娟许健李斌冉多良储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水... 详细信息

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水化合物的佐剂具有良好的生物相容性和易代谢的优点,同时,基于碳水化合物的佐剂种类广泛,且每种都有不同免疫特性,如基于多糖的佐剂可以增强巨噬细胞的吞噬活性及抗原提呈能力等。并且基于碳水化合物的佐剂还可与Toll样受体、C型凝集素受体等多种受体结合发挥上述免疫活性,但其作用机制尚不完全清楚。故本文基于碳水化合物的佐剂作用机制相关研究进展进行总结梳理,以期为相关佐剂的进一步研究提供参考。

关键词：基于碳水化合物的佐剂多糖佐剂作用机制研究进展